碳青霉烯耐药铜绿假单胞菌感染的分子流行病学及治疗

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa, PA)广泛存在于自然界，可定植于人类呼吸道、胃肠道和皮肤黏膜等部位，是院内感染常见条件致病菌，PA相关院内感染是导致高死亡率的独立危险因素^[1]。碳青霉烯类药物是治疗重症感染及耐药菌感染的重要药物，但碳青霉烯耐药铜绿假单胞菌(carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa, CRPA)感染，因药物有限、治疗棘手，对患者及临床治疗构成严重威胁。WHO将CRPA列为亟需研发新型抗菌药物的重点病原体^[2]。中国细菌耐药监测网(CHINET 2022)发布的监测结果显示，在339 513株临床分离菌株中，PA位居第四（8.03%），仅次于大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌和金黄色葡萄球菌，且对亚胺培南及美罗培南的耐药率分别为22.1%和17.6%^[3]。临床工作者需持续关注CRPA耐药机制、分子流行病学特征及防治措施，以促进CRPA感染的合理防治。

一、PA对碳青霉烯类的分子耐药机制

碳青霉烯类药物主要通过与青霉素结合蛋白(penicillin-binding proteins，PBP)结合并使其失活而抑制细菌细胞壁合成^[4]。CRPA的耐药机制主要包括外排系统过表达、膜通透性下降、产碳青霉烯酶与生物膜等。

（1）外排泵通过降低胞内抗菌药物浓度引发耐药，PA耐药相关外排泵均属于耐药-节结化-细胞分化（resistance-nodulation-cell division，RND）转运蛋白家族，与耐药性最相关的是：MexAB-OprM、MexCD-OprJ、MexEF-OprN和MexXY-OprM^[5]。

（2）外膜微孔蛋白（outer membrane porins, OMP）具有运输作用，PA所具的微孔蛋白OprD，能特异性透过碱性氨基酸和肽类物质。一般认为，OprD2是除美罗培南外的碳青霉烯类药物^[6]进入PA的主要特异性通道，当该通道蛋白缺失或功能异常时可导致PA对碳青霉烯药物耐药^[7]。

（3）碳青霉烯酶的产生是发生CRPA的重要机制，我国以A类酶中的KPC和B类酶中的IMP和VIM为主^[8,9]。B类酶属于金属β-内酰胺酶（metallo-β-lactamases, MBL），在PA临床分离株中最常见，MBL以Zn²⁺为主要配体，发挥对β-内酰胺类药物的水解作用^[10]，编码MBL的基因多位于质粒、转座子或Ⅰ类整合子上，易致耐药性在细菌间传播。

（4）PA生物膜的形成基于个体细菌在群体范围内多种连接信号转导途径的协调，称为群体感应（quorum sensing，QS)，能显著降低抗菌治疗效果。QS包括Las、Rhl、PQS和IQS这4种常见途径，它们在细胞内产生同源自诱导剂分子^[11]，这些化学通讯系统分子有望成为非传统抗菌药物治疗的新靶点。

二、CRPA的分子流行病学特点

PA的碳青霉烯耐药率在世界范围内各异，大多数国家为10%~50%，加拿大和多米尼加共和国较低（分别为3.3%和8%），而澳大利亚、北美地区和一些欧洲国家则为10%~30%。相比之下，巴西、秘鲁、哥斯达黎加、俄罗斯、希腊、波兰、伊朗和沙特阿拉伯的耐药率均超过50%，值得高度关注^[12]。在全球范围内，碳青霉烯酶的酶型分布差异性很大，MBL居首位，尤其是VIM，其次是IMP和NDM^[12]。部分地区已发现产KPC和GES的PA克隆，而OXA型依然最少^[12]。

多基因序列分型(multilocus sequence typing, MLST)是基于序列类型(sequence type, ST)鉴定克隆最常用的方法。根据感染率、传播范围以及与多重耐药（multi-drug resistance, MDR）/广泛耐药(extensive drug-resistance, XDR)谱,特别是与水平获得性β-内酰胺酶[如超广谱β-内酰胺酶(extended-spectrum β-lactamases，ESBLs)和碳青霉烯酶]的相关性，全球前10位的PA高风险克隆包括ST235、ST111、ST233、ST244、ST357、ST308、ST175、ST277、ST654和ST298^[13]。与全球数据不同，中国前10位高风险克隆为ST244、ST277、ST235、ST274、ST292、ST316、ST699、ST357、ST270和ST313^[14]。综合全球及我国的分布特点，前5位高风险克隆为ST235、ST111、ST233、ST244和ST277（见表1）。根据序列类型与中心等位基因谱（基因型）的相似性区分不同克隆复合物(clonal complex, CC)，上述克隆多在各自CC中作为原始株或创立者（founder），发挥着重要的创立者效应（founder effect，FE），FE是指由带有部分等位基因的少数原始株产生新群体，该群体数量增加但存在基因差异性甚小的遗传效应。

1．ST235与CC235

ST235作为CC235的创立者，其在中国和世界范围内都位列高危克隆的前三，值得关注^[15]。ST235与O11抗原血清型密切相关，表达细胞外毒素U（exotoxinU，exoU）+Ⅲ型分泌系统（type Ⅲ secretion system，T3SS）基因型（表1）, O11是第三常见的抗原血清型，流行率为13.3%，仅次于O6（17.8%）和O1（15.4%）^[16]。ST235在全球范围内传播，与多种β-内酰胺酶有关（见表2），包括A类和B类的多种碳青霉烯酶。ST235菌株中的绝大多数MBLs是IMP变体，包括bla_IMP-1、bla_IMP-2、bla_IMP-4、bla_IMP-6、bla_MP-7、bla_IMP-10、bla_IMP-15、bla_IMP-26和bla_IMP-31^[17]。事实上，ST235水平获取的耐药相关决定簇（包括整合子、转座子和质粒）呈现压倒性优势^[18]，这可能与DprA(一种参与转化物种同源重组的决定簇) ^[15]有关，DprA在ST235中的特异存在，可能会使ST235获得和维持外来耐药基因的能力更强。ST235比其他高风险克隆的致死率更高^[19]，这不仅与O11相关^[16]，也与exoU和T3SS的外毒素相关^[20]。

2．ST111与CC111

ST111为CC111的创立者，是仅次于ST235的第二大高危克隆，其与O12抗原血清型密切相关，表达exoS+T3SS基因型(表1)，虽为exoU阴性，它仍显示出较强的毒力^[20]。目前已有欧洲、美洲及亚洲的多个国家报道产VIM-2型MBL的ST111，其常见的β-内酰胺酶种类及基因见表2。据报道，已经有个别ST111分离株可只依靠ESBLs、OprD孔蛋白缺乏和MexXY-OprM外排泵过表达而对碳青霉烯耐药，且无任何MBL^[21]。GIM型MBL由整合子编码，其与IMP型MBL的同源性约为43% ^[22]。迄今bla_GIM仅见于ST111，并几乎只在德国流行^[17]。在ST111中，还发现一些苯唑西林酶,如bla_OXA-2、bla_OXA-9、bla_OXA-10、bla_OXA-17、bla_OXA-46、bla_OXA-74、bla_OXA-101和bla_OXA-142^[17]。

3．ST233与CC233

ST233是CC233的创立者，显示出exoS+（exoU-）T3SS基因型，并与最常见的抗原血清型O6相关（表1）,常见的β-内酰胺酶种类及基因见表2。该克隆在初期被认为对多黏菌素敏感，但2013年已报道XDR菌株对多黏菌素耐药^[23]。与ST111类似，ST233的显著特征与VIM-2型MBL相关。对ST233的XDR菌株（名为K34-7）的全基因组测序显示，其基因组由一条染色体和一个小质粒构成，XDR K34-7的表型由染色体中三种Ⅰ类整合子中的耐药基因编码，包括aac（3）、aac（3）-Ⅰ、aac(6')-Ⅱ、aadA2和aph（3'）-Ⅱb，bla_OXA-4、bla_OXA-486、bla_PDC-3和bla_VIM-2，catB、cmlA6和floR，dfrB5、fosA、tetG以及在质粒上的四环素外排泵基因，该完整基因组可在GenBank上获取^[24]。

4．ST244与CC244

ST244是CC244的创立者，显示出exoS+（exoU-）T3SS基因型，与抗原血清型O2相关（表1），常见的β-内酰胺酶种类及基因见表2。与之前研究^[14]结果相似，2023年发表的广东省临床CRPA研究^[25]同样提示ST244可能是我国最高危克隆。但一项西班牙的研究显示^[26]，ST244的4个分离株中，1株为MDR，1株对1~2种抗菌药物敏感，2株对研究中的所有抗假单胞菌药物敏感，尽管在该克隆中能测到广泛的水平获得性β-内酰胺酶基因，但该结果仍提示ST244与耐药不一定呈强相关。

5．ST277与CC277

ST277是CC277的创立者，显示出exoS+（exoU-）T3SS基因型，与抗原血清型O2相关（表1），常见的β-内酰胺酶种类及基因见表2。除在中国较为常见外，ST277也在巴西高度传播^[27]。产SPM-1的CRPA主要归属ST277，几乎只在巴西报道，其他碳青霉烯耐药基因包括bla_IMP-1和bla_OXA-56等。

三、CRPA感染的防治策略

针对PA的疫苗，部分在动物试验中表现良好，但均未通过临床试验，迄今无PA疫苗获批上市^[28]。CRPA感染大多为医院获得性感染，切断其院内传播途径是关键，CRPA感染（含定植）患者应单间或同类隔离，并由专人护理^[29]。污染的水槽会促进耐药菌传播和院内感染暴发，若有条件，建议移除CRPA患者直接治疗区域（如病房、治疗室）中的水槽^[29]。

CRPA感染病的治疗尽可能根据耐药机制不同而定，一些CRPA可能对非碳青霉烯类药物敏感，如头孢吡肟、环丙沙星、阿米卡星和磷霉素等^[30]，但占比小。这些药物可作为联合治疗的补充，但需基于体外药敏结果。对于CRPA甚至MDR-PA所致的感染，局部抗菌药物使用不失为一种有效的辅助疗法，如治疗CRPA肺炎或颅内感染时，可用抗菌药物（如多黏菌素类或氨基糖苷类）雾化吸入或脑室/鞘内给药。

1．产MBL CRPA感染的治疗

面对CRPA严重感染者，欧洲指南^[31]建议，使用多黏菌素、氨基糖苷类及磷霉素中的2种体外敏感的药物。多黏菌素通过破坏细菌的磷脂，导致渗透失衡和细胞裂解而发挥抗菌作用。PA对多黏菌素的耐药率为4.4%^[32]，多黏菌素与多种抗菌药物具有协同效应^[33]，给药方式包括全身及局部单独或联合使用^{[34,35,36,37]}，相关的荟萃分析提示联合用药优于单独使用^[38]，但应注意其潜在的肾毒性和神经毒性。阿米卡星属于氨基糖苷类药物，能与核糖体作用，抑制蛋白质合成而杀菌；磷霉素是一种磷酸烯醇丙酮酸类似物，通过抑制肽聚糖合成的第一步而杀菌，与其他抗菌药联用能显著提高抗CRPA活性^[39,40]。

2．不产MBL CRPA感染的治疗

对于产丝氨酸酶者目前以β-内酰胺类/酶抑制剂复方制剂为主，头孢洛扎/他唑巴坦、亚胺培南-西司他丁/瑞莱巴坦(relebactam)、美罗培南/法硼巴坦、头孢地尔在我国未上市，头孢他啶/阿维巴坦是可及的药物，头孢他啶是对PA活性最高的头孢菌素。阿维巴坦是针对A类(包括TEM、SHV、CTX-M、KPC、GES、PER和SME)、C类和部分D类(OXA-48、OXA-24、OXA-40和OXA-69)的β-内酰胺酶抑制剂；但对B类金属酶无活性^[41]（见表3）。对大多数β-内酰胺酶，它是可逆（非自杀）抑制剂，拥有更长清除半衰期。头孢他啶和阿维巴坦联合可用于产非MBL酶CRPA感染的治疗。若耐药机制测定确认仅为微孔蛋白D2丢失的CRPA感染，可用头孢他啶、头孢他啶/阿维巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、头孢哌酮/舒巴坦等治疗。

四、结语

PA感染属于难治性感染，CRPA感染更为棘手。ST235、ST111、ST233、ST244和ST277是世界及中国范围内常见的高危克隆。在我国，CRPA以产VIM等金属酶为主。现有的酶抑制剂对金属酶无效，预防CRPA高危克隆的传播显得尤为重要。

引用: 唐骢宸, 由屹先, 吕晓菊. 碳青霉烯耐药铜绿假单胞菌感染的分子流行病学及治疗 [J] . 国际流行病学传染病学杂志, 2023, 50(4) : 229-234.

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