腹膜透析相关性腹膜炎病原微生物诊断技术的研究进展

腹膜透析相关性腹膜炎(PDRP)是腹膜透析(PD)常见的一种并发症，其常会导致一些严重的并发症，如技术失败、转血液透析治疗等情况，长期、严重的腹膜炎发作还会引起腹膜功能和结构的改变，最终导致超滤衰竭，严重时还会导致死亡，所以，早期识别腹膜炎、及早使用适当的抗生素治疗是非常必要的^[1,2,3]。根据2022年国际腹膜透析学会(International Society for Peritoneal Dialysis，ISPD)^[1]建议，当满足以下3个标准中的2个时，即可诊断腹膜炎：①患者腹痛和(或)腹膜透析流出液浑浊；②腹膜透析流出液(驻留时间>2 h)中白细胞计数>100/μL或>100×10⁶/L；③腹膜透析流出液微生物培养检测呈阳性。

腹膜炎的病原微生物诊断多根据腹透液病原微生物培养来确定，然而，等待结果回报常需要一定的时间，这段时期大多数患者采取的是经验性治疗为主，而无效或治疗的延误很可能会导致腹膜炎加重、复发。目前，世界卫生组织已经确定多重耐药菌已经成为全球人类生命健康的威胁之一，而不适当的治疗和过度使用抗生素是导致病原菌多重耐药的主要原因。如果可以快速识别病原微生物，就意味着可以更安全、更针对性地使用抗生素，减少多重耐药细菌的出现。随着医学的发展，目前腹膜炎的病原微生物诊断技术方面也取得了很大的进展，本文将从传统细菌培养、特殊病原学诊断技术、分子诊断技术三个方面对目前PDRP病原微生物诊断技术进行概括及论述，旨在为临床诊疗提供指导作用。

1　传统细菌培养

目前PDRP最常用的细菌培养的标准方法仍然是将腹透液送至微生物实验室进行常规细菌培养，不同的致病菌鉴定方法包括浓缩、白细胞裂解和Bact/Alert系统，目前指南上推荐的培养步骤主要是将50 mL腹透液的沉淀物和5～10 mL腹透液分别于床边接种至2个血液培养瓶当中，并于6 h内送至实验室，把50 mL的腹透液置于3 000 r/min的离心机中离心15 min，然后收集其沉淀物悬浮于3～5 mL无菌盐水中，随后将其接种到标准的固体培养基和血液培养基中，培养阳性标本再进一步进行病原学鉴定、识别。

传统的细菌培养具有操作简单、快速、技术要求不高、经济实惠、可提供药物敏感性信息等优点，同时具有一定的诊断敏感性和特异性，目前仍是临床上最主要的病原微生物检测方法。但这种方法可能需要几天时间才能培养和鉴定出致病菌，并且受细菌数量、抗生素治疗等影响。故目前需要探讨一些新的诊断技术以快速识别PDRP病原体。

2　特殊病原学诊断技术

2.1　结核性腹膜炎(tuberculous peritonitis，TBP)

TBP是PD患者最常见的肺外结核感染形式，目前结核菌培养仍然是TBP诊断的金标准，然而其培养技术要求高，培养时长需要6～10周，此时，诊断和治疗的延迟将导致炎症持续发展，并极大地增加了拔除PD导管及转血液透析治疗的可能性，这极大地增加了患者的治疗负担^[4]。

2.1.1　中性粒细胞与淋巴细胞比值(the neutrophil-to-lymphocyte ratio，NLR)

当机体受病原体感染、炎症或异常免疫反应时，血液中的白细胞数量、形态和功能会发生迅速变化，而急、慢性炎症和免疫系统之间的关系往往体现在中性粒细胞和淋巴细胞技术上，NLR是由中性粒细胞数量除以淋巴细胞数量得出，目前已有研究发现，血液NLR可以作为评估终末期肾脏病患者全身炎症的生物标志物^[5]。

为评估NLR是否可用于早期鉴别PD相关性细菌性腹膜炎及TBP，Fung等^[6]进行了一项回顾性研究，研究发现，TBP患者其腹透液中NLR水平较细菌性腹膜炎及培养阴性腹膜炎患者低；当腹透液中NLR<15时，诊断TBP的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值为81%、70%、97%和22%；为进一步评估NLR对TBP及非结核性腹膜炎的预测效果，行ROC曲线分析得到曲线下面积(AUC)为0.83，这也提示腹透液在预测结核性腹膜炎中具有很好的表现。但是，研究中也存在不足之处，该研究只对金黄色葡萄球菌、结核分枝杆菌等病原体进行了分析，故还需要进一步的研究来评估NLR在其他病原体感染诊断中的适用性，如凝固酶阴性葡萄球菌、大肠埃希菌、真菌等。

2.1.2　结核菌特异性γ干扰素(IFN-γ)酶联免疫斑点测定检测(Elispot)技术

IFN-γ释放反应(Interferon-gamma Release Assays，IGRAs)检测，是指人体对结核分枝杆菌的免疫反应主要通过T细胞活化介导，当结核分枝杆菌致敏的T细胞再次接受结核相关抗原刺激后会释放出IFN-γ，并最终可通过Elispot技术检测出来。有学者曾对22例腹膜炎患者的血液及腹透液标本进行INF-γ Elispot检测，发现CAPD患者合并TBP时，腹透液中IFN-γ特异性T细胞表达是外周血的4～9倍；收集腹透液、外周血分别行INF-γ Elispot检测，阳性结果诊断TBP的敏感性为77.8%、55.6%，特异性为84.6%、92.3%，AUC为0.927、0.825，并且当腹透液中结核菌重组蛋白抗原(ESAT-6)阳性判断阈值为100.0斑点数时，其TBP诊断敏感性均达到77.8%，特异性为84.6%^[7]。研究表明，INF-γ Elispot可作为临床诊断TBP的一种快速检测方法，与外周血相比，对腹透液进行检测，可更有效、准确地诊断CAPD合并TBP。

2.1.3　结核分枝杆菌及利福平耐药检测(Xpert MTB/RIF)

Xpert MTB/RIF是一种半巢式实时荧光PCR体外诊断技术，可对结核分枝杆菌复合群DNA以及利福平耐药性基因进行检测^[8]。该测试最早主要用于痰液、肺泡灌洗液等标本来诊断肺结核疾病。研究发现，与传统培养结果相比，Xpert MTB/RIF检测非呼吸道样本，敏感性和特异性可达到81.3%和99.8%，且该检测方法对腹水、滑膜腔、心包积液等样本均具有很好的敏感性(86%～100%)；但就Xpert MTB/RIF对PD患者TBP诊断的敏感性和特异性尚没有进一步研究^[9]。

近年来，有2例PD患者文献病例报告，在PD患者出现腹痛、腹透液浑浊后，腹透液早期革兰氏染色、抗酸杆菌涂片、常规微生物培养中均为阴性的情况下，通过Xpert MTB/RIF检测发现了结核分枝杆菌的DNA片段，并最终通过抗结核治疗后病情完全好转^[10]。目前，结核分枝杆菌培养仍然是TBP诊断的金标准，但是即使使用现代化液体培养技术，其阳性结果时间也长达10周，这都会导致诊断和治疗时间的延迟^[4]。多项研究发现NLR、INF-γ Elispot、Xpert MTB/RIF等方法均可以实现TBP的早期诊断，从而有助于增加早期抗结核治疗的证据。

2.2　真菌性腹膜炎

真菌性腹膜炎是PD患者中不常见的并发症，其发病率为1.0%～23.8%，但其病死率很高，并且，超过一半的PD合并真菌性腹膜炎患者，由于其腹膜功能的改变，后续须更改其他肾脏替代治疗方式^{[11,12,13,14]}。目前ISPD指南建议PDRP发生时应采取有效的抗真菌治疗，并且在确诊为真菌性腹膜炎后立即拔除腹透导管，故寻找敏感的实验室标志物用于早期真菌性腹膜炎的诊断是非常必要的^[1]。

2.2.1　β-(1→3)-D葡聚糖[β-(1→3)-D-glucan，BG]、半乳甘露聚糖(galactomannan，GM)

BG和GM均是一种存在于大多数的真菌的细胞壁当中的多糖。在真菌感染过程当中，真菌细胞壁中的BG和GM均可释放被释放到组织环境当中，并且其在真菌培养阳性前1～2周均可被检测出来，故目前已有研究提出BG和GM可作为侵袭性真菌病的早期诊断生物标志物^[15]。

为评估PD患者其腹透液中的BG和GM是否具有真菌性腹膜炎的诊断价值。Worasilchai等^[16]研究发现，真菌性腹膜炎组患者的腹透液中BG、GM水平均要显著高于细菌性腹膜炎组。然而，有趣的是，BG水平升高不仅存在于真菌性腹膜炎患者，在其他病原体感染的患者当中，其腹透液BG水平也会升高，如：铜绿假单胞菌、大肠杆菌、凝固酶阴性葡萄球菌；而GM水平升高也并非存在于所有的真菌性腹膜炎患者当中，如白色念珠菌感染患者，其腹透液GM水平升高并不明显。同时，研究还发现，由于部分非真菌性腹膜炎的患者其腹透液中BG和GM水平较高，PDE诊断阈值水平会高于血清阈值水平，当BG≥240 pg/mL、GM≥0.5 pg/mL时，其诊断真菌性腹膜炎的敏感性为100%和69%，特异性为83%和63%，AUC分别为91.7%和72.1%，与GM相比，BG似乎是诊断真菌性腹膜炎更有效的生物标志物^[16]。

2.2.2　抗氧化物质-钾、白蛋白、维生素B12

腹膜炎会引起氧化应激反应而导致抗氧化物质减少，而钾、白蛋白、维生素B12等已发现其具有结合金属离子、清除氧自由基、调节细胞、生长因子的产生等作用，都被认为是血液中与氧化应激反应相关的抗氧化剂，与腹膜炎的发生息息相关^{[17,18,19,20,21]}。Liu等^[22]为评估钾、维生素B12、白蛋白等是否可预测真菌性腹膜炎而进行了一项回顾性研究，研究发现，当K^＋<3.05 mmol/L、白蛋白<29.5 g/L、维生素B12<558 pg/mL时，诊断真菌性腹膜炎的敏感性为71.43%、85.71%、71.43%，特异性为69.52%、59.62%、59.62%，AUC值为0.758、0.766和0.641。尽管研究结果发现这些抗氧化物质诊断真菌性腹膜炎的敏感性和特异性尚不是很高，但也提示氧化应激反应可能是真菌性腹膜炎的一种潜在标志，且该研究是一项横断面回顾性研究，并且未对腹透液中抗氧化物质进行检测，未来可能仍需进一步多中心、前瞻性等研究来验证氧化应激与真菌性腹膜炎之间的关系。

3　分子诊断技术

如上所述，传统细菌培养检测技术较成熟、阳性预测价值高，故目前仍然是病原学诊断的金标准，然而很多时候细菌培养常依赖病原体的活力，相当多病原体无法通过常规体外培养检出，而且存在目标病原谱窄、培养时间长、阳性率低、精确度低等局限性；目前，随着诊断技术的逐渐发展，越来越多的分子诊断技术也在不断发展，从单个分子诊断到多重PCR再到高通量测序的宏基因组检测，均为感染性疾病的精准诊断提供了重要手段。

3.1　16S rRNA基因测序

16S rRNA基因测序是一种成熟的快速准确鉴定细菌种类的工具，16S rRNA是原核生物的核糖体中30S亚基的组成部分，具有高度的保守性和特异性。16S rRNA基因是细菌上编码rRNA相对应的DNA序列，存在于所有细菌的基因组中。16S rRNA基因包括保守区和可变区，保守区反映了物种间的亲缘关系，而可变区则反映了物种间的差异。这两个区域呈交替排列，保守区可用于设计通用引物进行目的片段的扩增，通过对高变区的分析可以辨别细菌种类。自2006年，Sogin等^[23]最早应用16S rRNA测序技术对深海微生物群落进行分析开始，16S rRNA基因测序已经成为当前研究微生物群落组成和分布的重要手段。2013年Ahmadi等^[24]就曾对45例PDRP患者分别进行了传统培养及16S rRNA基因测序技术的比较，结果在传统培养中，45例PDRP患者中有35例腹透液样本细菌培养阳性，2例真菌培养阳性。通过16S rRNA基因测序在38例样本中检测到细菌DNA，2例样本中检测到真菌DNA。同时，van Hougenhouck-Tulleken等^[25]的另一项研究提出16S rDNA扩增子的高通量测序(next-generation sequencing，NGS)还有助于检测多个微生物的感染，其研究也是对16S rDNA扩增子测序技术与传统培养方法进行比较，发现25例样本中NGS技术可明确检测出24例样本中的33种不同的细菌，除外1例培养出非念珠酵母菌的样本，相反，传统培养的方法仅有10例样本培养出13种细菌。有研究也提出，在大多数腹透液样本中，16S rRNA基因测序均可以准确地发现样本中存在的主要病原体(属水平以上)，并且与培养的结果符合率可达到80%。除了真菌及培养阴性的传统培养结果，符合率可达到100%。然而，这两位作者都指出了同样的问题，16S rRNA基因测序技术主要用于鉴别属水平病原体，不能明确地分辨出遗传相似性较高的病原体，但16S rRNA可以用作腹透液样本中病原菌的快速筛查工具，可作为常规培养的补充方法。

3.2　聚合酶链式反应/电喷雾电离质谱仪(PCR/ESI-MS)

PCR/ESIMS是一种PCR与ESI-MS结合的裂解和提取DNA的方法，主要用于快速鉴定血液中的细菌和念珠菌。该方法通过利用自动脱盐和去除DNA平台来制备用于质谱分析的扩增产物，然后采用电喷雾电离质谱分析平台对一个或多个样本中的扩增子序列变体进行识别，最后采用计算机根据多位点扩增子碱基的组成特征和质量控制来进行细菌及念珠菌的检测^[26,27]。Johnson等^[28]曾进行了一项定量PCR方法与传统细菌培养进行比较，发现在14例腹膜炎患者中，定量PCR检测的敏感性和特异性为67%及79%。而Chang等^[29]曾使用PCR/ESI-MS对21例腹透液样本进行分析，其中由18例样本可鉴定出微生物，而传统培养仅有16例样本中培养阳性。并且采用PCR/ESI-MS和培养阳性在对15种微生物进行鉴别时，两种技术在属水平的鉴别一致率为100%，种水平上一致率为87.5%。但是，香港一中心也曾进行了一项研究，发现采用PCR/ESIMS对腹透液进行检测时，其检出率与血液及其他无菌液体样品并不相同，超过50%腹透液标本中并未能准确识别出致病菌，而采用另外一种基于PCR原理的方法(该方法使用通用的细菌引物，但不能区分细菌种类)进行检查时则都可检测到细菌DNA，导致这种检测性能的差异的原因目前暂不清楚，但推断可能与检测样本的不同物理、化学性质相关，如高乳酸、高糖、低镁等^[30]。根据以上研究，目前PCR/ESI-MS使用于临床检测病原体的敏感性其实仍存在异议，尽管其可检测出病原体的相关耐药性基因信息，但是却不能像传统培养方法一样提供详细的抗菌药物敏感性信息来指导临床抗生素治疗。

3.3　宏基因组高通量测序技术(mNGS)

mNGS不依赖于传统的微生物培养，直接对临床样本中的核酸进行高通量测序，然后与数据库进行对比分析，根据对比到的序列信息来判断样本包含的病原微生物种类，能够快速、客观地检测临床样本中地较多病原微生物，且无需特异性扩增^[31]。目前mNGS已被发现可用于协助感染性疾病的病原学诊断，如：肺部感染、神经系统感染^[32,33]。Ye等^[34]对30例PDRP患者样本分别进行了传统培养及mNGS检测，研究发现mNGS阳性率要明显高于传统培养方法；同时，传统培养中始终都只能发现1种病原体，但是其中8例腹透液样本经mNGS检测可发现2种及2种以上病原体，这均表示与传统培养方法相比，mNGS可识别出更多的病原体。此外，研究还发现，mNGS还可检测到传统培养中难以检测到的病原体，如5、6B型疱疹病毒、伯纳特柯克斯体等等的病原体。病原体耐药性基因检测方面，Chen等[33]的研究发现，针对重症监护病房的肺部感染患者，mNGS技术可检测到44.24%的样本中存在一种或多种含有耐药基因的细菌。另一研究也通过对单一型与混合型关节感染患者进行mNGS耐药基因检测，发现其结果预测准确率分别可达到74.1%和76.5%，并且在病毒耐药基因检测方面同样具备明显优势^[36]。然而，鉴于目前国内外关于mNGS在PDRP诊断中的应用价值仅有零星报道，尚没有研究对PDRP患者耐药性进行基因分析。相较于传统培养，mNGS通过无偏倚性地直接检测样本中地全部核酸，的确可为腹膜炎的诊疗提供更多具有价值的信息，如检测时效性更好、阳性率更高、可同时检测出样本中地多种病原体及耐药性基因。但是其也存在一定的不足，首先，mNGS的成本远高于传统培养；同时在对一些具有较厚细胞壁的病原微生物及RNA病原体的临床检出率和敏感性较低；而且目前根据检测分析结果来区分背景菌和致病菌尚存在一定困难。

3.4　病原特异性免疫指纹

病原特异性免疫指纹指的是根据不同的病原体感染机体后发生的特定免疫学特征，并对这些特定的"免疫指纹"进行定量及定性的评估，从而识别出不同病原体的技术方法^[37]。研究发现，当革兰阳性菌、革兰阴性菌感染时，其免疫指纹特征会显著不同，革兰阳性菌感染情况下，其CD4^＋和CD8^＋T细胞数量、CXCL10、INF-γ、IL-22等趋化因子水平明显升高；而革兰阴性菌感染时主要以大量中性粒细胞浸润及IL-1b、IL-10、TNF-α等细胞因子升高为主^[38]。病原特异性免疫指纹检测技术可以区分革兰阳性菌和革兰阴性菌，可以早期、快速、准确识别感染，从而更准确、更有针对性地指导临床选择抗生素治疗方案，避免不适当或过度使用抗生素而使药物耐药；遗憾的是，特异性免疫指纹的方法仍无法提供关于抗生素耐药性的相关信息。

3.5　矩阵辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析(matirx-assisted laser desorption ionization of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)

MALDI-TOF MS是一种相对较新、快速、可靠的微生物鉴定方法^[39]。Lin等^[40]进行了一项回顾性研究，研究纳入了155例的PDRP患者，首先通过收集患者腹透液接种到BACTEC培养瓶中进行培养，然后培养阳性标本分别进行传统细菌鉴定(n＝98)和MALDI-TOF MS(n＝57)方法进行病原菌鉴定，研究发现MALDI-TOF MS方法相较于传统细菌培养方法，其病原菌鉴定时间都要更短、更快速，不同病原菌节省的时间为37～68 h，平均节省时间为64 h，并且该研究还发现使用MALDI-TOF MS早期鉴别病原菌还可有效缩短患者住院时间，遗憾的是，其并不能减少抗生素敏感性测试所要时间。

4　总结

综上所述，PDRP病原微生物诊断新技术正在逐步发展，但是这些新的诊断技术仍存在一定的局限性，目前传统细菌培养仍然是PDRP致病菌诊断的金标准。尽管如此，我们仍然相信，随着临床诊断技术的发展，这些新的诊断技术未来将会逐渐进步和完善，进而为PDRP诊断提供全新方向。目前，仍需要进一步研究来评估PDRP病原微生物诊断新技术在现代临床医学环境中的适用性。

引用: 何宇健, 王蓬蓬, 王旭, 等.  腹膜透析相关性腹膜炎病原微生物诊断技术的研究进展 [J] . 国际泌尿系统杂志, 2024, 44(2) : 364-368.

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