CAR-T疗法的深入总结

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▉ 导读

随着科学技术的发展，很多医学难题逐渐得到改善。对于血液性恶性肿瘤而言，时下最流行的治疗方法莫过于CAR-T疗法 (chimeric antigen receptor T cells)。2021年，国内首款CAR-T产品上市(截止目前全球共有7款CAR-T产品上市，其中国内2款，分别来自复星凯特和药明巨诺)，标价120万人民币，相较于美国均价40万美元的CAR-T产品而言，着实实惠了很多。

高昂的治疗费用，突破性的治疗效果，改善困扰医学界多年的难题，这些吸睛的字眼都可以用来描述CAR-T这一先进细胞治疗手段。随着CAR-T细胞免疫疗法本土化研发、生产的发展，医保及保险公司的加入，未来将会成为常规肿瘤治疗手段，更多的惠及民众。

全球CAR-T上市产品（截止时间2021.09）

任何事物发展都有其历史，科学研究也不例外，其中有传承，有坎坷。CAR-T疗法属于过继免疫疗法（ACT）的一种，其家族中还包括TIL，TCR-T，CAR-NK等历史或未来有希望的方法。（医学研究就好像股市一样，不能说哪种方法好，哪种不好，不同的方法，不同的适应症，不同的适用对象，今天的效果不佳，可能会随着相关学科的发展，成为明日的黑马，正如mRNA技术一样，随着新冠疫苗的热门而被搬向台前。）最早成功的癌症过继免疫疗法案例是1956年E. Donnall Thomas教授通过双胞胎间骨髓移植治疗白血病，避免移植物抗宿主病（GVHD）-即供体特异性免疫细胞由于未经过受体抗原免疫耐受而发动攻击对受体造成多脏器损伤甚至引起死亡。同时，导致移植失败。（这就好像两军对战，虽然都是同类，但由于各侍其主，一定要斗个鱼死网破，两败俱伤。）

随后，Miller等人发现了T细胞起源-源于造血干细胞（胎儿骨髓和心脏），成熟于胸腺。直到1986年Steven Rosenberg报道了一项关于肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）的研究，才将人们的目光锁定在“通过患者自身的免疫细胞可以对抗自身癌症”的理念上。

1992年，Sadelain等人成功地建立了逆转录病毒介导的基因转移到T淋巴细胞的方法，使基因修饰成为在实验或治疗环境中控制免疫的手段。这些都为CAR-T技术的产生做了铺垫。

图源 https://scrubbing.in/car-t-therapy-genetically-re-engineering-your-cells-to-target-cancer/

谈及CAR-T技术，不得不涉及TIL，TCR-T，CAR-NK，这些免疫细胞来源的天然和人工衍生物，在细胞治疗肿瘤领域有着千丝万缕的联系。

▉TIL

TIL (tumor-infiltrating lymphocytes) 治疗一般从患者肿瘤组织中提取TIL，经体外扩增培养后回输入病人体内。2002年，来自于美国国家癌症研究所（NCI）的Steven Rosenberg教授就将此法用于转移性黑色素瘤患者治疗。

TIL制备示意图

TIL疗法有诸多限制：1、不是所有患者的肿瘤组织都会产生淋巴细胞 2、提取的淋巴细胞不一定有抗肿瘤活性 3、即便有抗肿瘤活性患者也不一定能等待8周的时间以扩充培养这些淋巴细胞。因此，尽管有高达50%的治疗响应率，TIL疗法却没能得到广泛应用。

这些限制促使研究人员寻求更具广泛意义的T细胞。在TIL疗法前后治疗数百例黑色素瘤患者的过程中，研究人员发现不同患者的TIL可识别一些相同的肿瘤细胞高表达的抗原，如MART-1、gp100等。基于这些发现，针对这些特定抗原的T细胞将具有潜在的治疗效果。这些尝试，将T细胞疗法推向靶向时代和重组改造时代。

▉TCR-T

TCR-T制备过程

TCR-T (T-cell receptor-engineered T cells) 通过基因导入方法，将抗原特异性TCR导入患者T细胞，制备人工TIL。Steven Rosenberg研究组从一个黑色素瘤患者体内选取了2个TIL细胞克隆: DMF4、DMF5。这两种细胞系都对MART-1/HLAA*02(A2)（一种HLA亚型）有亲和力。患者的外周血T细胞被收集起来，并通过反转录病毒导入DMF4的TCR基因。

TCR结构

这种方法避免了TIL复杂的分离过程，初步临床试验结果在2006年发表，12个黑色素瘤患者中有2位患者有治疗响应。尽管响应率远低于TIL疗法，但初次证实了基因改造的T细胞具有治疗效果。

TCR-T 筛选

TCR-T的治疗效果与TCR亲和力有关，低亲和力TCR无法获得高治疗响应率(可达80%)，高亲和力TCR毒性增强，易脱靶 (TCR与机体正常组织抗原发生作用，严重时可致人死亡。)

除了MART-1，临床上常用的TCR-T靶点还包括gp100，CEA、NY-ESO-1、MAGE等。除了自身抗原，也有研究员将目光投向外源抗原，如HPV(人乳头瘤病毒，与宫颈癌发生密切相关)病毒抗原。

TCR-T疗法展示了一定的治疗潜力，但仍有诸多限制，如组织相容性抗原（HLA）配型、抗原需要呈递到细胞表面等。

TCR-T制备之不同方式外源基因导入示意图

▉CAR-T

CAR-T疗法的出现大大拓展了T细胞疗法的应用范围。CAR-T也是通过基因导入方法（腺病毒，慢病毒，非病毒载体方式等），将抗原特异性CAR导入患者T细胞，发挥杀伤肿瘤功能。

CAR由4部分组成: 1,胞外靶抗原结合域 2,铰链区 3,跨膜结合域 4,胞内信号传导结构域。

CAR-T和TCR-T结构区别

胞外靶抗原结合域由抗原特异性单克隆抗体scFv (VH和VL通过柔性接头连接构成的单链可变片段) 构成，VH和VL之间的相互作用方式以及互补决定区的相对位置会影响CAR对其目标表位的亲和力和特异性。CAR亲和力是影响CAR功能(识别抗原，传导信号，激活T细胞)的重要指标，同TCR一样，过低过高的亲和力都不能收获理想的效果。除了CAR亲和力，表位位置，靶抗原密度也是CAR设计时需要考虑的问题。

铰链区属于胞外部分，是跨膜结合域在胞外的延伸 (为了与靶抗原结合域连接)。其功能是克服空间障碍，以允许scFv和靶抗原表位结合。长铰链可提供更大的柔韧性并允许更有效地接近膜近端表位或复杂的糖基化抗原，而短铰链更能成功地结合膜远端表位。实际上，通常根据经验确定适当的铰链区长度，并且必须针对每个特定的抗原结合域量身定制。

跨膜结构域的主要功能是将CAR锚定在T细胞膜上，研究表明，其也可影响CAR表达水平，稳定性，在信号传导或突触形成中发挥作用，并与内源性信号传导分子二聚化有关。

胞内信号传导结构域直接影响CAR活化T细胞效果。根据结构不同可将CAR分为四代：

一代CAR仅含有CD3分子ζ链的ITAM区，无法有效激活T细胞，临床疗效有效甚至没有临床疗效。二代CAR在一代CAR的基础上，在胞内添加了一个来自共刺激分子CD28或者CD137（4-1BB）的ITAM区，胞外的抗原识别区与靶抗原结合后，可使T细胞同时获得抗体刺激信号及共刺激信号。这使得二代CAR的活化能力远远强于一代，同时也在临床治疗中展现了较好的治疗效果。一般认为，CD28所传递的活化信号，相较于CD137更强，可使T细胞在较短时间内达到很高的杀伤活性；而CD137所传递的活化信号则会维持的更加持久。由于二代CAR-T细胞使用的转染病毒载体多为逆转录病毒，可容纳及携带的基因片段有限，难以将CD28和CD137这两个共刺激信号分子的ITAM区同时转染入T淋巴细胞内，因此人们不得不在获得CAR-T细胞更强的激活强度与活化持久度中进行选择。

CAR结构和1-4代CAR区别

三代CAR的主要结构与二代CAR大同小异，但三代CAR使用了慢病毒作为转染载体，与逆转录病毒载体相比，慢病毒载体致癌风险更低，临床应用更安全。同时可携带更大的基因片段进入T淋巴细胞，因此，其CAR胞内段常常可以含有2个或者更多的共刺激信号ITAM区。理论上，第三代CAR-T细胞相较于第二代CAR-T细胞应该更具活化及杀伤能力，然而有研究表明，第三代CAR-T细胞杀伤活性并没有获得明显的提升。

四代CAR的设计思路通常是对CAR-T细胞进行调控，如增加自杀基因，减少肿瘤清除后对自身正常组织损伤，或添加细胞因子，趋化因子受体结构实现肿瘤组织浸润，达到实体瘤杀伤效果等。

早在2008年，Fred Hutchison肿瘤研究所等机构就开展CAR-T细胞对B细胞淋巴瘤治疗的研究，虽然治疗结果不太理想，但该临床实验证实了表达CD20靶点的CAR-T细胞治疗是相对安全的。

2010年NCI报道了一则通过CD19靶点CAR-T有效控制患者B细胞淋巴瘤的事例，由于CD19在人体B细胞表达，因此CAR-T在体内杀伤过程中，人体正常B细胞也会被清除，同时血清免疫球蛋白显著降低。但值得庆幸的是，人体在一段时间内可耐受B细胞的耗竭，这一报道为CAR-T细胞在B细胞淋巴瘤领域的大规模使用奠定了基础。

2011年，美国宾夕法尼亚大学的Carl June教授及其团队将特异性识别CD19的CAR-T细胞用于B细胞来源的慢性淋巴细胞白血病治疗，显示了“治愈”的疗效，随后在复发难治性急性淋巴细胞白血病展开临床实验，也取得了良好的疗效。

CAR-T细胞制备示意图

鉴于这一突破性的进展以及其他免疫调控手段的发展，Science杂志将肿瘤免疫治疗评为2013年科技突破进展第一名。由此，CAR-T细胞免疫疗法轰动了世界，各国开始大量开展基于CAR-T细胞的科学研究和肿瘤治疗的临床试验。

Fred Hutchison携手Juno,NCI携手Kite,宾大携手诺华分别在2017-2021年将自己的CAR-T产品推向市场。礼来、葛兰素史克、强生、默克等知名药企也纷纷通过投资介入CAR-T领域。

然而，CAR-T技术的应用不是没有风险的，其还面临诸多挑战。

CAR-T细胞输注后，可能会出现诸如发热、炎症、肝酶异常升高、呼吸困难、发冷、思维混乱、头晕、严重恶心、呕吐和腹泻等副作用。所有患者均有长期B细胞再生障碍，可通过服用丙种球蛋白缓解。毒性主要有两类：细胞因子释放综合征（CRS）和神经毒性（NTX）或CAR-T细胞相关脑病综合征（CRES）。

CAR-T副作用

幸运的是，CRS一般可以通过减少输注T细胞的数量和/或通过服用抗IL-6受体单克隆抗体和类固醇来缓解。及时管理毒性对于降低与免疫治疗相关的死亡率至关重要，因此，研究人员制定了不同的安全策略来克服和预防CAR-T细胞毒性，如设计新一代的CAR(四代CAR)。毒性管理已成为CAR-T细胞免疫治疗成功的关键步骤。

CAR-T细胞耗竭是患者疾病复发的主要原因。

CAR-T细胞抑制性受体表达增加 (因抗原持续刺激造成，包括PD-1、Lag3、Tim3和TIGIT等)，自身分泌L-2、TNF-α和IFN-γ的能力下降，转录因子、代谢和表观遗传修饰调控等，均可作为CAR-T细胞耗竭的成因。

为避免耗竭，PD-1阻断抗体已被使用以提高CAR-T治疗效果。与此同时，患者靶基因发生突变，也应作为CAR-T细胞治疗效果不佳或复发的考虑因素。

由于个体间HLA (human leukocyte antigen ，人类白细胞抗原) 差异，目前CAR-T细胞生产均以患者自体血液中T细胞为材料，实行定制化生产。样本批间差异大，生产耗时费力，成本高，运输难度高，任何环节的差错都会造成医疗事故。单批次制备，可用产品数量有限，患者无法及时，快速得到新批次治疗产品。通用型CAR-T产品将会成为未来CAR-T细胞治疗的发展趋势，通过基因敲除或破坏供体上的TCR基因和/或HLA I类基因座来消除GVHD，如此，健康供体提供的T细胞更容易得到，质量更好，通过大批量生产，可降低CAR-T细胞成本，惠及更多民众。

 TCR-T和CAR-T联合杀灭肿瘤细胞

与CAR-T细胞相比，CAR-NK细胞更容易实现异体回输。目前，关于CAR-NK的研究，包括自体和同种异体两种。在自体环境中细胞因子释放综合征和神经毒性较CAR-T细胞降低；通过IPSC（诱导型潜能干细胞）的使用可以提供了无限量的“现成”NK细胞；对恶性细胞具有快速反应，而不会引起GVHDs；存在多种机制激活细胞毒性等成为CAR-NK的研究亮点。当然，CAR-NK的开发也包括诸多难点，如确定用于免疫治疗的NK细胞的最佳来源、最佳载体系统、最具有生物学相关性的CAR激活信号域和理想的体外扩增策略等。未来的细胞治疗必将是多学科、多方法交叉的产物，与单克隆抗体，溶瘤病毒，化疗药物的有机结合，必将使细胞治疗大放异彩。

多方法联用杀灭实体瘤

参考文献：

1. Chimeric Antigen Receptor-TCells: A Pharmaceutical Scope. Front Pharmacol. 2021.08.20; 12: 720692.

2. CAR-T design: Elements and their synergistic function. EBioMedicine. 2020；58：102931.

3. CAR‑T Engineering: Optimizing Signal Transductionand Efector Mechanisms. Biodrug, 2019.

4. Chimeric Antigen Receptor T-Cell Therapy: The Light of Day for Osteosarcoma. Cancers (Basel). 2021.9.5;13(17):4469.

5. Production and Application of CAR T Cells: Current and Future Role of Europe. Front Med (Lausanne). 2021.8.16;8:713401.

6. TCR Redirected T Cells for Cancer Treatment: Achievements, Hurdles, and Goals. Front Immunology. 2020 Sep 3;11:1689. 

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