【LorMe课堂】揭开新型铁载体“GBT”的神秘面纱

作者：郭亚迪，南京农业大学访学硕士，来自郑州烟草研究院。选修了植物营养元素的土壤化学这门课。知识共享，共同进步。 

创新没有捷径，如果有，那就是阅读高质量文献。LorMe课堂主要展示研究生课程文献研讨环节的作业。本期主题为铁载体，共有16名研究生在课堂上分享了文献阅读。首期LorMe课堂由郭亚迪同学为您揭开新型铁载体“GBT”的神秘面纱，来自Naturechemical biology的一篇文章。特别喜欢郭同学汇报时清晰的逻辑思路和演讲激情。感谢他们的贡献，也期待其他同学的分享。

导读

地球上的生命严重依赖于铁(Fe)，铁在能量生产、生物合成等众多的生物化学反应中发挥着重要作用。虽然铁是地壳中最丰富的元素之一，但有氧条件下生物利用不可利用。为了从环境中捕获这种重要元素，策略性的吸收铁的复杂小分子转运体来已经进化出来。微生物和植物能吸收由这种复杂小分子转运体——铁载体螯合的可溶性铁。已知的铁载体结构有数百个，但值得一提的是，铁载体内铁的配体系统类型几乎没有变化。几乎所有的铁载体具有如下三个结构（图1），异羟肟酸型、儿茶酚盐型和水杨酸型配体来吸收环境中的铁元素。近来，科学家发现自然界的禾本科类作物的根际细菌（Paraburkholderia graminis）具有一种新型铁-配体系统（Diazeniumdiolate）的铁载体（Gramibactin）。或许大家会有疑问：这种新型的铁载体有什么样的结构？螯合铁的能力如何？有什么功能？那下面请各位读者随我一起揭开它神秘的面纱。

图1 铁载体所具有的三个结构：儿茶酚酶、异羟肟酸和水杨酸盐

溯源

科学家从禾本科类作物（玉米和小麦）的根际细菌（Paraburkholderia graminis）分离出C4D1M菌株，之后进行了基因组序列挖掘，发现了一个铁载体生物合成的基因，一个非核糖体肽合成酶（NRPS）基因簇（grb），科学家初步认为这一基因簇负责铁载体GBT的合成。

为了检测该的铁载体，科学家在培养基中培养了P.graminis，并从液体培养基上清液中检测到了两个物种m/z 888.2910[M+ 2H] ⁺ 和 m/z835.3793 [M+ H] ⁺，对应的化学组成分别为，C ₃₂ H ₅₂ O ₁₆ N ₁₀ Fe和C ₃₂ H ₅₅ O ₁₆ N ₁₀ （图2）。由此可见，他们之间仅仅相差1个Fe和3个质子，所以可以得出结论，这两种物质其一为铁载体，另一种为铁载体和铁的螯合物，即gramibactin及其相应的铁络合物。

图2 从P. graminis上清液中检测到的两种铁螯合物的同位素模式和特征质量差异

实验验证与实验结果

基因敲除验证GBT合成基因簇

为了证实被鉴定的基因簇能产生铁载体，科学家通过插入抗氯霉素盒破坏grbI产生一个NRPS缺失突变体，当P.graminis ΔgrbI生长在CAS培养基，培养基没有颜色的改变（图3左），并且没有gramibactin被检测出来（图3右）。因此，GBT由grb基因簇合成。

图3 左图ΔgrbI菌株由于敲除GBT的合成基因簇，因此其所在培养基区域的没有由蓝色变为黄色。右图 ΔgrbI菌株的培养液没有检测出GBT存在。

新型的铁—配体系统

    通过对grb基因簇产生的新型铁载体（gramibactin）进行结构分析，发现了它螯合铁的秘密，具有一种新型的配体系统——N的亚硝基羟胺配体系统（图4）。众所周知，铁载体通过配体系统释放质子进行去质子化配体络合作用螯合铁，这一新型铁载体也不例外。它通过释放甲基上的4个质子（双链），来进行去质子化配体的络合作用来螯合铁，进而被植物吸收。

图4  新型的铁—配体系统（在铁载体上为相同双链结构，图中列举其中一条），N的亚硝基羟胺配体系统，通过释放甲基上的4质子（H）进行去质子化配体的络合作用

GBT螯合铁的能力

为了评价铁载体的实际功效，科学家使用分光光度计滴定和电位滴定法来测定GBT的酸碱习性，以此来确定螯合物复合物的形成常数。通过采用EDTA二钠作为竞争性螯合剂进行了一系列的滴定实验，确定了logβ在27±0.1的时候，GBT在大范围的pH值范围下能形成了高度稳定的三价铁螯合物，螯合能力堪比“细菌异羟肟酸铁载体”（图5）。

图5  GBT与铁的螯合物在大范围的pH下没有发生溶解，表明其螯合能力稳定且较强，堪比细菌“异羟肟酸铁载体”。

植物能否吸收GBT螯合的铁

为了证实寄主植物能否吸收GBT螯合的铁，科学家用⁶⁸Ga作为示踪核素在了水培玉米植株上进行了实验。经比较，未螯合和螯合金属的标准摄取值（SUV）没有显著差异，印证了GBT并不影响植物对金属的吸收，即寄主植物能吸收与GBT螯合的铁（图6）。

图6  寄主植物对⁶⁸Ga-GBT, ⁶⁸Ga均有吸收，且两者的吸收水平差异不显著

植物是否能利用与GBT螯合的铁

为了证明植物能否利用与GBT螯合的铁，科学家进行了活体实验。玉米植株分别生长在缺铁、添加Fe-EDTA和Fe-gramibactin的溶液中，作为阳性对照。种植在可溶性的铁、未与Fe螯合的螯合剂（EDTA、gramibactin）中，作为阴性对照。将测定的鲜嫩叶片中叶绿素的含量作为实验依据，因为叶绿素的生物合成强烈依赖于铁的有效性。生长在阴性对照下的植物叶片颜色比生长在阳性对照下的植物叶片的颜色要浅的多。提取的叶绿素定量实验也证明了表型的差异。而且，无铁培养的植物叶片含有的总叶绿素含量为0.9-1.0μg/mg。HR-CS-AAS（高分辨连续源原子吸收光谱法）的测定结果进一步证明了第三叶叶绿素含量的升高与地上部具有较高的铁含量有关（图7）。因此，植物能吸收、同化与GBT螯合的铁。

图7  左边为阴性对照与阳性对照的玉米植株中叶绿素含量，从图中可以看出阴性对照的叶绿素含量显著低于阳性对照，阳性对照各处理间差异不显著。右边的图为玉米植株地上部干物质含量中Fe元素的含量，进一步证实了这一结果。

未来展望

众所周知，植物主要通过两种已知的途径——还原酶、铁载体来获取环境中的铁。近来科学家发现的这种罕见的螯合铁的配体系统（N-亚硝基羟胺配体系统）不仅为我们认识自然界中发生的Fe螯合反应奠定了一定的基础，也促进了铁载体相关分子功能设计的工作进程。此外，基因组的挖掘表明该铁载体广泛存在于自然界的植物中，尤其是禾本科植物以及具有根瘤菌的豆类作物，这也为植物能从自然界获取足够的铁元素提供了可能。

课程评价

以下摘录了郭同学课程作业中两段内容，是对文献的评价以及上课的体会。

1.论文内容

论文整体内容详实，为读者讲述了一个完整的故事。先提出充满现实意义的科学实验假设，然后采用抽丝剥茧般层层深入的实验来进行验证，其采用的实验分析标准、精确，可信度高，令人为之信服。文中所用辞藻华丽，语法完整，让读者拥有“take home message”般的阅读体验。

2.课程收获

老师是一名认真、负责、友好的朋友。虽然老师的课课时数少，但是我收获颇丰。首先，我战胜了自己，和组员完成了高质量英文文献的阅读、翻译、整理、汇报，从阅读中文文献勇敢的向阅读高质量的英文文献迈出了关键的一步。其次，老师教会了大家要勤于思考、善于发现问题，甚至不惜撕下友好的面孔以“严师”的面目“逼迫”大家提问，因为老师知道，这是一种很有效的学习方式。最后，很有幸在南农访学的这一年内遇到老师和各位优秀的博士师兄、师姐以及同学，能和大家一起学习，共同进步！

原文:Gramibactin is a bacterial siderophore with a diazeniumdiolate ligandsystem 

期刊:Nature Chemical Biology，Sep 2018.

DOI: 10.1038/s41589-018-0101-9

作者:HermenauR et al.

关键词:Iron acquisition; Plants; Rhizosphere; Microorganisms; Biosynthesis

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