原创 | 不容错过！了解更多基因编辑利器CRISPR系统的突破技术 | 医麦盘点

2019年1月16日/医麦客 eMedClub/--CRISPR如今已成为一把基因编辑利器，被应用于农业、药物开发、疾病机制研究等诸多方面。而在应用过程中，CRISPR系统的脱靶效应一直是备受关注的问题。为了改善CRISPR系统的脱靶效应，科研工作者们做了较多努力，得到了一些突破技术。接下来，本文将围绕这些产生的突破技术展开，主要包括4个方面：

1. Base Editing

2. dCas9

3. Cas9Nickase

4. ProCas9

Base Editing

传统的CRISPR- Cas9基因编辑技术，已经允许科研工作者们以较轻松方便的方式对目的基因进行编辑。事实上，这种编辑对于基因敲除显得更容易，而对于带来“点突变”的基因敲入还是显得较为困难。即便引入“供体”DNA，使发生双链断裂后的细胞修复以同源重组的方式进行，但是还是只能得到较低的同源重组效率，并引起更多的DNA缺失和插入。

正如哈佛大学化学生物学家刘伟（David Liu）所说，“事实证明，大多数与疾病相关的人类遗传变异属于基因的点突变，而且单碱基突变的含量是传统基因编辑技术效率无法应对的。”

David Liu （图片来源：forbes.com ）

2016年，David Liu团队便推出了单碱基基因编辑技术。Base Editing

不产生双链断裂，利用dead Cas9和APOBEC以及UGI融合实现C→T（或者G→A）。

其中，APOBEC是一类胞嘧啶脱氨基酶，能催化C脱氨基变成U，而U在DNA复制过程中会被识别成T。UGI（Uracil DNA glycosylase inhibitor）是尿嘧啶糖基化酶抑制剂，能防止尿嘧啶糖基化酶将U糖基化引起碱基切除修复，使U逆转成C。

单碱基基因编辑确实极大地扩充了实现点突变的工具箱，但是其局限性也显而易见——只能实现C→T（或者G→A）。

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后来张峰团队推出了“REPAIR”系统，在RNA水平实现了A→G。该系统的主要组成是PspCas13b和ADAR2。

张锋（图片来源：news.mit.edu ）

Cas13酶是特异靶向RNA的RNA“剪刀”， 张峰团队设计的dead Cas13使酶失去剪切的功能而只是牢固结合特定RNA序列。ADAR2蛋白催化A变成次黄嘌呤I，而在RNA翻译过程中I会被识别读成G（也就实现了RNA水平的A→G）。

该系统允许临时校正致病的单核苷酸突变，不会永久性地改变基因组，因而可能更为安全，为基础研究和临床治疗提供了一个新的工具。

David Liu团队使用张锋实验组类似的策略，实现了DNA水平的T→C，扩大了单碱基基因编辑的应用范围。

两者的研究成果于2017年10月分别在Nature和Science上发表。

Base Editing技术原理图

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dCas9

dCas9（dead Cas9），即Cas9的RuvC1和 HNH两个核酸酶活性区域同时发生突变。因此，dCas9只保留由gRNA引导靶向基因组的能力，剪切酶活性全部消失。

将dCas9与其他效应蛋白融合（之前介绍的Base Editing也是如此），包括转录因子、GFP、组蛋白修饰、抗体等，以实现基因调控、基因组成像、染色质或DNA修饰以及染色质免疫沉淀等。

dCas9与效应蛋白融合示意图

在Juan Carlos IzpisuaBelmonte课题组的研究中，为了克服dCas9/sgRNA和协同转录激活复合物的编码序列超出了通用AAV容量的技术难题，研究人员对CRISPR/Cas9系统又进行了改进。

采用缩短的sgRNA，引入MS2回路，使其不需要与Cas9融合，就能以独立方式募集转录激活蛋白MS2–P65–HSF1 (MPH)。而且缩短的sgRNA9（dgRNA）使得即使与野生型Cas9结合形成复合物，该复合物也不会对靶基因进行切割。

利用上述改进，便可以将基于CRISPR的转录激活组分用2个AAV载体编码：一个编码dgRNA和转录激活蛋白MPH，另一个编码Cas9。

Cas9Nickase

CRISPR-Cas9技术的潜在脱靶效应可能是由Cas9核酸酶活性引起的。 为了改善由Cas9核酸酶活性引发的脱靶效应，开发了Cas9 Nickase。

Cas9 Nickase是Cas9的突变形式， 是由RuvC1和 HNH两个核酸酶活性区域中其中一个核酸酶活性区域突变而成。 这种突变形式产生单链缺口而不是在靶位点的双链断裂。

利用Cas9 Nickase进行基因组编辑，需要两个gRNA而不是一个。 两个gRNA将被设计在相反的DNA链上且紧密接近（序列相距不超过20bp），以确保一旦两条链被Cas9 Nickase切割时，就会产生DNA双链断裂。

这种配对的Cas9 Nickase减少了脱靶效应，因为两个gRNA需要一起作用才能产生DNA的双链断裂。一旦双链DNA断裂，NHEJ或HDR路径将被激活以完成基因组编辑过程。

Cas9 Nickase介导的单链断裂

两个gRNA的作用形式

ProCas9

近日，Cell 上发表了来自美国加州大学伯克利分校Savage团队一篇题为CRISPR-Cas9 Circular Permutants as Programmable Scaffolds for Genome Modification的文章。

研究人员利用一种称为循环排列（circular permutation）的技术，构建出一套称为Cas9-CP的新型Cas9变体，这将简化Cas9融合蛋白的设计，使得它们能够用于除了简单的DNA切割之外的多种应用，比如碱基编辑和表观遗传修饰。

研究人员将“永远开启（always-on）”的Cas9分子转变为可激活的开关。这些开关保持在“关闭”位置，直到它们被蛋白酶激活。由此产生的蛋白酶感应的Cas9（protease-sensing Cas9, ProCas9）能够减少脱靶效应并实现分子感应，以及组织或器官特异性的基因组编辑。他们证实ProCas9可用于检测病毒蛋白酶，有望用作一种能够引发免疫反应的病原体感应系统。

Cas9始终处于“开启”状态使得缺乏对这种蛋白的活性的控制，且难以靶向特定细胞或组织，从而能够导致不想要的基因组编辑和更大的脱靶基因组损伤，并且阻止使用Cas9作为细胞事件的分子记录器。

Savage团队使用循环排列来重新设计Cas9的分子序列，因而更好地控制它的活性并为融合蛋白构建更优化的DNA结合支架。这种Cas9重新连接方法涉及将这种蛋白的末端（即它的氨基端和羧基端）与肽接头（peptide linker）连接，同时在不同的位置上分割它的序列，从而产生新的相邻的氨基端和羧基端。

结语

正如文章开头所说，CRISPR-Cas9技术已被广泛应用于研究和开发过程。而研究工作者们也在为更充分地应用这一技术努力，更多的相关技术将继续为大家呈现！

参考出处：

CRISPR hacks enable pinpoint repairs to genome

Gene-editing hack yields pinpoint precision

Novel CRISPR-derived ‘base editors’ surgically alter DNA or RNA, offering new ways to fix mutations

Programmable base editing of A•T to G•C in genomic DNA without DNA cleavage

New Version of CRISPR, Developed by Feng Zhang-Led Team, Can Target and Edit RNA

Darren J. Burgess. CRISPR Therapies — Making the Grade Not the Cut. Nature Reviews Genetics. 2017, 12December

Hsin-Kai Liao, Fumiyuki Hatanaka, Toshikazu Araoka et al. In Vivo Target Gene Activation via CRISPR/Cas9-Mediated Trans-epigenetic Modulation. Cell, 2017,171, 1495–1507.  

Biotechnology: Rewritinga genome

In Vivo Target Gene Activation via CRISPR/Cas9-Mediated Trans-epigenetic Modulation. Cell, 2017,171, 1495–1507

CRISPR-Cas9 Circular Permutants as Programmable Scaffolds for Genome Modification

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