重磅丨张锋团队发现第三个可用于人类基因组编辑的CRISPR-Cas系统，高活性、低脱靶、小尺寸更适用于体内编辑丨医麦猛爆料
2019年1月23日/医麦客 eMedClub/--美国麻省理工学院-哈佛大学Broad研究所张锋团队报告了第三个可用于人类基因组编辑的CRISPR-Cas系统。
这项研究于1月22日发表在Nature Communications上，证明了新的酶可以被设计用于靶向并精确切割或编辑人类细胞的基因组。与化脓性链球菌Cas9（SpCas9）相比，这款来自外村尚芽孢杆菌（Bacillus hisashii）的Cas12b（BhCas12b）具有高靶特异性和小尺寸，使得该新系统适用于体内应用。
张锋PI组（图片来源：Zhang Lab）
基于不同的效应蛋白，CRISPR-Cas系统被分为两类：1类CRISPR-Cas系统利用多个蛋白效应器复合物（multi-protein effector complexes），而2类CRISPR-Cas系统利用单个蛋白效应器。目前的基因组编辑技术主要集中在2类CRISPR-Cas系统，其中包含用于特异性切割DNA双链的核酸内切酶。 然而，迄今为止只有两类2类核酸酶被用于人类细胞的基因组编辑:
Cas9，一种由两个RNA引导的核酸酶，同时需要CRISPR RNA (crRNA) 和tracrRNA，并且包含HNH和RuvC核酸酶结构域；
Cas12a，一种由单个RNA引导的核酸酶，只需要crRNA和包含一个 RuvC结构域。
与Cas9和Cas12a一样，Cas12b同属于2类CRISPR-Cas系统。后者是一种由两个RNA引导的核酸酶，同时需要crRNA和tracrRNA，并且包含一个RuvC结构域。Cas12b蛋白通常比Cas9和Cas12a小，因此从细胞内通过病毒载体传递的角度来看很有吸引力。
2类CRISPR-Cas系统（图片来源：Cell）
早在2015年，该团队已将Cas12b（当时称为C2c1）鉴定为三种有前途的新型CRISPR酶之一，但面临一个障碍：因为Cas12b来自嗜热菌 - 它们生活在炎热的环境中，如间歇泉、温泉、火山和深海热液喷口 - 这种酶自然下只能在高于人体温度的温度下工作。例如，来自酸土环脂芽孢杆菌（Alicyclobacillus acidoterrestris）的Cas12b（AacCas12b）在48℃具有最佳的DNA切割活性。
自从Cas12b酶家族首次被描述并被证明是RNA指导的DNA核酸内切酶以来，几个研究小组一直在研究这一类酶。
2018年11月27日，中国科学院动物研究所研究团队发表在Cell Discovery的报告说，成功地鉴定出另一种来自酸性脂环酸芽孢杆菌（Alicyclobacillus acidiphilus）的Cas12b（AaCas12b）。经过系统改造，两种Cas12b酶被成功开发成为哺乳动物基因组编辑工具，可以在31℃-59℃温度范围内对哺乳动物基因组进行编辑，且具有更低的脱靶性，更适用于临床基因治疗。据悉，该研究团队已于一年多前提交了专利申请，并正在开发这项技术在基因治疗中的应用。
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在最新发表的文章中，张锋等人探索了活跃在较低温度下的Cas12b酶家族，以用于人类基因组编辑。张锋说道：“我们从大自然中寻找灵感，想要创造一种可以在较低温度下运行的Cas12b版本，因此我们扫描了数千种细菌基因序列，研究可以在哺乳动物环境的较低温度下繁殖的细菌。”
他们发现BhCas12b最有希望，值得一试。然而，他们还发现，在37℃时，野生型BhCas12b优先切断非靶DNA链，这种行为在较低温度下更加明显。由于不能高效切割目标链，降低了 BhCas12b作为基因组编辑有效核酸酶的潜力，研究人员尝试通过蛋白质工程来解决这一局限性。
鉴定嗜温Cas12b核酸酶（图片来源：Nature Communications）
“我们测量了两个目标位点的插入缺失活性，共有176个BhCas12b单突变体，发现几个突变的活性增加，包括K846R和S893R，它们作为双突变体表现出增强效应，”作者写道。“最终确定的BhCas12b v4突变体，其中含有K846R/S893R/E837G，在多个靶标上表现出最高活性。”
当在人类细胞中测试BhCas12b突变体时，研究人员发现它在37°C时表现出增加的dsDNA（双链DNA）切割活性，并且带切口的dsDNA（nicked dsDNA）明显减少。
稳健的基因组编辑工具应该是一种有效的、针对一系列目标的特异性工具。在跨越293T细胞的5个基因的56个靶点上，BhCas12b v4在ATTN PAMs上具有很强的切割能力，而在TTTN和GTTN PAMs的一个子集中，活性也很高。此外，对人类基因组中ATTN流行度的分析显示，BhCas12b v4与Cas12a酶可达到的靶位点数量类似。与SpCas9和AsCas12a相比，BhCas12b的indel模式分析显示5-15 bp的缺失较大。
此外，BhCas12b v4与单链寡核苷酸（ssODN）供体的共转染促使在TTTC PAM靶标处与SpCas9和AsCas12a相当的编辑效率，并且在ATTC PAM靶标处具有比SpCas9更高的编辑效率。
为了进一步评价BhCas12b v4在人类细胞中的作用，研究人员测试了Cas12b核糖核蛋白(RNPs)编辑人原代T细胞的能力。通过电穿孔将BhCas12b v4-sgRNA复合物导入人CD4+ T细胞。Bhcas12b v4 RNPs 在三个测试目标中显示出32-49%的indel率。
总之，这些数据表明BhCas12 v4可以作为一种有效的可编程核酸酶应用于各种基因组编辑环境，包括治疗相关的人类细胞类型。
但是，单有有效性还不够，要知道仅仅在去年，就有好几篇文章质疑CRISPR-Cas9基因编辑系统的脱靶效应可能远远超乎我们的认知！一时间众CRISPR公司就股价下跌，并且向外表示在研究中并未发现大规模脱靶。可见，脱靶效应仍然是CRISPR领域一个伤不起的话题啊~
因此，对于这个全新的CRISPR-BhCas12b系统，严谨的研究人员分析了其在人类细胞中的全基因组靶向特异性。Guide-Seq分析显示，在不同的Cas核酸酶之间选择的9个具有可比活性的靶位点中，BhCas12b v4没有发现任何的靶外位点，而SpCas9在9个中的6个导致了明显的脱靶断裂，与其他报告一致。
BhCas12b具有高度特异性（图片来源：Nature Communications）
这意味着，除了上述“大幅提高”的切割效率的优势，BhCas12b还拥有比SpCas9更高的特异性。此外，作者指出“BhCas12b是一种相对紧凑的蛋白质（1,108个氨基酸），因此与SpCas9和AsCas12a相比，更适用于腺相关病毒的有效包装。”作为第三个可用于人类基因组编辑的CRISPR-Cas系统，未来可期！
Broad研究所和麻省理工学院正在广泛分享Cas12b系统。与早期的基因组编辑工具一样，这些机构将通过质粒共享网站Addgene上的张锋实验室（Zhang lab）页面免费提供该技术用于学术研究。
CRISPR领域正在迅速发展，用“日新月异”来描述一点也不为过。新的研究通过对天然多样性的探索和对有希望的候选酶的合理工程的结合，设计了能够有效编辑原代人T细胞中基因组的Cas12b版本，这是针对或利用免疫系统的治疗剂的重要的初始步骤。
重要的是，该研究还为其他CRISPR核酸酶作为基因组编辑工具的工程提供了前进的方向。正如本文第一作者Jonathan Strecker博士说的那样，“这进一步证明有许多有用的CRISPR系统正在等待被发现”。
参考出处：
http://news.mit.edu/2019/scientists-engineer-crispr-cas12b-dna-targeting-0122
https://www.genomeweb.com/gene-silencinggene-editing/crispr-researchers-engineer-cas12b-ortholog-human-genome-editing#.XEfH81wzbIU
https://www.nature.com/articles/s41467-018-08224-4
https://www.nature.com/articles/s41421-018-0069-3
https://www.cell.com/action/showImagesData?pii=S0092-8674%2816%2931754-8
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