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mRNA疫苗研发,这些技术挑战你解决了吗?丨医麦新观察

江江 医麦客 2021-04-01

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2020年11月5日/医麦客新闻 eMedClub News/--目前,mRNA技术领域的火热已无需多言,生物技术行业史上多次融资神话花落该领域;mRNA有两个非常有吸引力的应用方向,一个是用作癌症和病毒感染疾病的mRNA疫苗,另一个是针对不可靶向基因病的治疗。


疫苗在肿瘤免疫领域的广阔应用前景已使得这一个性化策略在2019年被《麻省理工科技评论》选为当年的“全球十大突破性技术”之一,其中基于mRNA技术探索癌症疫苗已经占据重要位置,而其今年在新冠肺炎这样的突发公共卫生事件中表现出的先发优势更是进一步推进了mRNA疫苗的上市进程。


继辉瑞/BioNTech和Moderna的新冠候选疫苗BNT162b2和mRNA-1273分别在欧洲(EMA)和加拿大进入上市申请阶段后,近日(10月27日),英国药品和保健品监管局(MHRA)也启动了对mRNA-1273的滚动审查程序。另外,辉瑞和Moderna此前都表示,预计将分别于11月和12月向美国FDA寻求其新冠mRNA疫苗的紧急使用授权(EUA)。mRNA疫苗进一步向上市逼近。


然,目前为止,全球还未有批准上市的基于mRNA的疗法(包括mRNA疫苗),新冠mRNA疫苗向上市的快速挺进,一部分是由于疫情大环境的催发,而此前该领域的候选产品,大多处于临床前和早期临床Ⅰ-Ⅱ期阶段,但这丝毫不影响开发者对这一领域的研发热情,越来越多的企业和机构对此进行布局。


而随着研究的深入,这一新兴领域的研发技术面临的挑战也逐渐明晰。为进一步推进将mRNA疫苗转化为人类疾病预防和治疗应用的设想,为这些技术难点寻找更优的解决方案是众多mRNA疫苗开发者的共同目标,也是推动使该领域向前进一步发展的重要驱动力。


总的来说,mRNA疫苗开发过程主要分为靶点抗原的筛选与发现、mRNA的生产、mRNA纯化、mRNA递送、产品安全性和有效性分析方法建立这几个核心环节。

 

聚焦mRNA的生产与纯化



mRNA作为疫苗技术的核心原理是将编码一种或多种免疫原的目标转录物传递到宿主细胞质中,并在此处翻译表达蛋白,然后分泌或位于细胞内。从结构上来看,mRNA疫苗可分为两大类:非复制型mRNA(NRM,non-replicating mRNA)和自扩增性mRNA(SAM,self-amplifying mRNA)。而无论是哪一种,其结构都包含有一个5‘端帽子结构(5‘ Cap)、一个3’端的poly(A)尾巴、5‘和3’端的非翻译区(untranslated regions,UTRs)和编码抗原(目的)蛋白的开放阅读框(ORF),通过体外转录(IVT)技术合成

 

mRNA生产(合成)过程从一个质粒DNA(pDNA)生成开始,该pDNA包含DNA依赖性RNA聚合酶启动子,如T7,和编码mRNA结构的相应序列。随后pDNA被线性化,作为DNA依赖性RNA聚合酶转录mRNA的模板,转录mRNA完成后通过DNase使模板降解。5'端结构和3'端poly(A)尾部的添加可在体外转录步骤中或转录后通过酶促完成。而接下来的纯化也是极其关键的一步。

体外转录(IVT)mRNA的结构及常用的修饰策略( 图片来源:参考出处2)

 

具体来说,对于疫苗接种的mRNA结构的设计,mRNA一旦释放到细胞质中,是为了有效地利用宿主细胞的翻译机制来产生足够数量的编码的免疫原,并适当地呈现给免疫系统。在整个领域中,几个关键的质量属性一直是最大化基因表达的工作重点。

 

非翻译区(UTR)序列:UTR发挥的众多作用包括调控mRNA从细胞核输出,调节翻译效率编排亚细胞定位以及mRNA稳定性。引入α-球蛋白3'端UTR可稳定mRNA,同时引入β-球蛋白5'端和3'端UTR可提高翻译效率。通过使用两个首尾相连的β-球蛋白3'端UTR可实现最佳效果。


结合α-珠蛋白和β-珠蛋白UTR已被用来调节RNA以优化体外转录,此外,用抗原编码的、UTR优化的mRNA转染的树突状细胞(DCs)已被用于巨细胞病毒血清阳性个体和癌症患者的免疫研究。


加帽(Cap):mRNA分子的5' 端帽结构对于有效翻译至关重要,并阻止核酸外切酶介导的降解,与mRNA的稳定性密切相关。mRNA的帽结构可能是以下三种不同的帽状结构之一,分别是cap-0 [m7G(5')pppN1pN2p],cap-1 [m7G(5')pppN1mpNp]和cap-2 [m7G(5')pppN1mpN2mp]。有两种不同的方法可以实现IVT mRNA的加帽,一种是在转录后加入加帽酶,产生与最常见的内源性真核帽结构相同的Cap(即m7G帽)。


另一种则是在IVT反应过程中添加合成的帽类似物,这是一种常用的加帽方法,但该方法的主要限制是体外转录所需的帽类似物和GTP核苷酸之间的竞争,导致部分mRNA未加帽和翻译失活。另外,特定的帽结构在蛋白质生产和免疫原性中都起着至关重要的作用,然而早期mRNA研究使用的m7GpppG帽类似物(也是目前临床试验中最常用的mRNA Cap)一部分会以反向方式掺入mRNA中,从而不能被核糖体识别,导致翻译活性较低。因此,引入抗反向帽类似物(ARCAs,anti-reverse cap analogs)可以降低加帽过程失误,确保正确的帽子定位在5’端的方向;应用ARCA加帽的mRNA在各种细胞类型中也表现出了优异的翻译效率。


poly (A)加尾:3'端poly (A)尾部在mRNA翻译以及mRNA的酶稳定性中起着重要作用,其可与几种多聚腺苷酸结合蛋白(PABP)结合,同时与5'端帽结构协同作用以调节翻译效率。其添加可通过在DNA模板中编码poly(A)尾部转录而来,或通过使用重组poly(A)聚合酶在转录后添加。但是,用重组poly(A)聚合酶进行聚腺苷酸化会导致尾部长度变化。因此,优选的方法是从编码poly(A)尾巴的DNA模板转录mRNA以产生长度明确的poly(A)尾巴。 


尾部长度等特性对mRNA分子的翻译和保护是至关重要的。通过将PABPs与poly(A)尾部和帽结构结合使mRNA循环的过程,需要一个足够长的poly (A)尾部。已有研究观察到,增加poly(A)尾部长度可提高多核糖体生成的效率,并因此影响蛋白质表达水平。此外,IVT mRNA的poly(A)尾部长度逐渐增加至120个碱基,会相应地增加了蛋白质表达水平,而超过此数量之后并未进一步增强蛋白质表达。

 

开放阅读框(ORF):核苷酸的密码子优化和修饰有助于翻译效率,比如使序列中各个密码子的比例更接近人体内天然的比例和修饰鸟嘌呤和胞嘧啶(GC)的含量以避免复杂二级结构形成等。已有研究证明,通过优化编码序列和去除不必要的炎症杂质的mRNA,可以在临床前成功实现蛋白质生产、最小的负面炎症反应,以及系统适应性免疫反应。密码子优化的IVT mRNA已成功用于针对病毒感染的疫苗研究和非病毒蛋白的表达。但是,对于某些mRNA疫苗来说维持原始ORF也可能是较为有益的。


作为全球科学服务的领导者,Thermo Fisher Scientific(赛默飞世尔科技)可提供一系列满足不同要求的体外转录试剂盒。例如mMESSAGE mMACHINE™ T7 ULTRA Transcription Kit可合成加帽加尾的RNA,含有专利的ARCA帽子,具有更高的活性;mMESSAGE mMACHINE™ T7 Transcription Kit可高产量的合成加帽RNA;MEGAscript™ T7 Transcription Kit则纯粹合成RNA单链,不加头或尾,使用者可根据自己的需求进行加帽、加尾。


而随着mRNA疗法的加速发展,常规的、研究级的体外转录试剂已不能完全满足需求,需要按照更高质量标准专门设计和生产的原材料。赛默飞除了可提供常规研究级的体外转录试剂外,还可提供专用于mRNA疗法的TheraPure试剂,其具有超高纯度且不含动物源成分,适用于工业级规模化生产。TheraPure产品线可为mRNA合成提供独特的完整解决方案,覆盖体外转录、转录后修饰及模板降解等流程。

 


纯度:mRNA的纯度是获益的关键决定因素。DNA依赖性RNA聚合酶由于启动失败事件产生较小寡核糖核苷酸杂质,以及自互补3'端延伸产生的双链(ds)RNA ,其可以导致I型干扰素和炎性细胞因子的产生。研究证明,去除mRNA制备物中的污染物会降低先天免疫反应,并导致体外报告蛋白表达水平显著提高。


纯化是非常重要的一步,通过体外转录获取mRNA包括多个纯化步骤,传统的酚氯仿或离心柱法纯化容量有限,且不适合用于自动化。基于磁珠的纯化技术更为灵活,体系可扩展且适合用于自动化。纯化后所得的原料药基于无菌性、一致性、纯度和效力测试便可配制成药物产品并放行。这些工艺使GMP设施可以在很短的时间内转换为新疫苗,因为反应材料和容器是相同的。

 

赛默飞MEGAclear™ Transcription Clean-Up Kit可以快速有效地从游离核苷酸、酶和缓冲液组分中分离高纯度RNA,适用于小规模纯化;基于Invitrogen Dynabeads MyOne Carboxylic acid和特有结合缓冲液的纯化方法可实现更高的mRNA回收率,更适合大规模纯化


磁珠大规模纯化

 

mRNA的递送是主要挑战



基于mRNA的疫苗极具潜力,但其最终在临床发挥药效的保证还取决于一个高效的mRNA递送系统,然而,与mRNA的超大尺寸、高负电荷、固有的不稳定性以及对酶促降解的高度敏感性相关的多种障碍使得其递送策略的开发壁垒高,阻碍了这种基于mRNA的疗法从实验室到临床的转化。因为众所周知,在不存在递送系统的情况下,mRNA在细胞膜上的渗透非常低,并且其半衰期约为7小时,又极易被降解。

 

因此,无论是在体内还是在体外,递送系统都是细胞内传递mRNA到作用的治疗部位的必要条件。人们研究了不同的方法来改善mRNA的递送,包括物理方法(如显微注射、基因枪给药、电转等)、鱼精蛋白聚合、RNA佐剂、以及将mRNA包封病毒载体或由脂质和/或聚合物组成的纳米颗粒中。

 

裸mRNA:裸mRNA的有效性在包括肌肉注射、皮下注射或皮内注射中已经得到证实。采用这种方法可以避免其他与系统性施用mRNA相关的障碍,例如,通过肝脏、肾脏和脾脏从血流中清除。然而,表皮最外层的角质层对局部给药的吸收形成了严密的屏障,因此,像微穿孔、微针、电穿孔、超生渗透等策略都被开发用于克服该障碍。然而,裸mRNA血浆半衰期短,易于降解,并且进入细胞困难等仍是其广泛应用的瓶颈。因此,急需进一步改进递送系统来保护mRNA并屏蔽其负电荷。

 

病毒载体:对于采用病毒进行的RNA递送,人们对工程化的AAV携带核酸荷载物表现了极大的兴趣。而RNA病毒的优点则是它们在细胞质中局部复制和表达。已经将甲病毒,小核糖核酸病毒和黄病毒用于mRNA递送。然而,使用病毒载体表现出与基因组整合相关的关键缺陷,以及可能的宿主排斥(免疫原性和细胞毒性),因此激发了对用于mRNA递送的非病毒载体的需求。

 

非病毒载体:可进一步分类为基于脂质的载体、基于聚合物的载体、脂质-聚合物杂合系统(LPNs)以及基于肽的载体等。目前,基于脂质体和脂质载体代表了最常用的非病毒载体,各种合成的和天然衍生的脂质已经被用来形成脂质体(脂质体和核酸的复合物被称为脂质复合体)或脂质纳米颗粒(LNPs),两者都被报道可以有效地递送基于mRNA的疫苗。


使用LNP作为mRNA的递送系统2015年被首次报道全球mRNA疫苗研发领域的巨头企业,Moderna、CureVac和BioNTech,均采用LNP递送技术,这也是目前核酸药物领域应用较广泛的一种递送类型。


另外,聚合物和脂质-聚合物杂化纳米颗粒在安全性、稳定性、高转染效率和低成本方面提供了广阔的前景。利用不同的纳米材料在mRNA制剂和递送方面的持续进步可以改善mRNA在治疗和预防传染病和癌症中的广泛应用。


更多优化创新的递送技术仍在不断开发当中,国内新锐企业本导基因BDmRNA递送专利技术提高了基因编辑用于在体基因治疗的安全性,此外,该公司还基于其核心Virus-like particle (VLP) mRNA递送技术开发了针对此次新冠病毒的mRNA疫苗。VLP是由病毒结构蛋白构成的空纳米颗粒,不含病毒遗传物质,因此该mRNA疫苗不涉及病原体,没有产生感染性病毒的风险。


▲部分用于mRNA递送的纳米级递送系统( 图片来源:参考出处2)

 

赛默飞Lipofectamine MessengerMAX就是一种专用于mRNA递送的转染试剂值得注意的是,该试剂即使在神经元和原代细胞中,也能获得60%以上的转染效率。

随着越来越多的技术瓶颈被突破,mRNA疫苗,或者是基于mRNA的其他治疗策略的潜力都将被进一步释放,最终造福广大患者。

 

参考出处:
1.https://www.nature.com/articles/s41541-020-0159-8
2.https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7076378/#B81-pharmaceutics-12-00102





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