聚焦CAR-T细胞改造，下一代CAR-T疗法路向何方？丨医麦新观察
2021年5月12日/医麦客新闻 eMedClub News/--嵌合抗原受体（CAR）主要由胞外的肿瘤抗原、抗体以及胞内的刺激分子组成。CAR的结构已发展至第四代、第五代。
第一代CAR的结构只有一个胞内信号传导结构域（主要是CD-3ζ或FcRγ），仅在T细胞表达单链抗体，靶向肿瘤细胞表面抗原分子，但存续时间短，限制了其发挥功效。
第二、三代，将共刺激信号分子（CD28、4-1BB等）组装进CAR，提升T细胞活化、存续和扩增。
第四代CAR追加引入促炎细胞因子（IL-12等），在具有免疫抑制性的肿瘤微环境中，通过释放促炎因子招募并活化更多免疫细胞，引起更广泛的抗肿瘤免疫效应。
第五代同种异体CAR-T，通过敲除异体T细胞可能造成免疫排斥的基因，为CAR-T疗法的大规模生产和即时应用提供了可能。
诺华的Kymriah和吉利德/Kite的Yescarta，二者的CAR结构均属于第二代。目前已在血液瘤中达到很好的临床缓解率。但CAR-T治疗的疗效仍有待优化，其现存的困难包括复发率高、实体瘤治疗效果较差、自体产品制备周期长等应用难点；以及细胞因子释放综合征、脱靶毒性等副作用。基于此，行业也在积极寻求突破，大力发展创新技术，进一步推动CAR-T细胞疗法的全方位发展。
下一代CAR-T改造思路
从CAR-T结构的角度出发，目前的优化策略主要可以分为以下几个方向：
CAR分子的改变。例如胞外scFv优化和铰链长度调整、共刺激分子和CD3结构域的优化等；
通过共表达、敲除或敲低内源性基因。例如共表达c-Jun、IL-12等，以及上述提到的敲除PD-1、IL-10等；
递送方式的改变。传统使用的都是病毒载体，现在趋势是使用非病毒载体，例如转座子或者mRNA等；
整合方式的改变。例如ARCUS & AAV、ZFN & AAV、CRISPR/Cas9 & AAV、非病毒等多种定点整合方式。
优化scFv
CAR主要由三个功能域构成，分别是胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域。CAR胞外结构域则由负责识别并结合抗原的单克隆抗体的单链可变片段（scFv）及一段起连接作用的铰链区（Hinge）构成。
CAR是以抗体的scFv（单链可变区）识别肿瘤抗原的，scFv由重链、轻链以及两者之间的柔性连接物（linker）组成，是CAR-T研发中的核心技术。对scFv的优化可以进一步细分为人源化scFv、多靶点的设计等；还可以从亲和力、linker长度等方面去优化、调整。
敲除TCR、HLA
敲除免疫负调节的基因
非病毒定点整合
▲ 图片来源：doi: 10.3390/cancers12061704.
▲ Gibco™ TrueCut™ Cas9蛋白
除了对CAR-T细胞的结构进行改造来优化其疗效，还可以通过使用更优的CAR-T生产工艺来实现。细胞治疗生产所专用的细胞培养基和试剂能够最大程度地减少污染和变异的风险，同时提供大量的可追溯性文档（包括FDA药物主文件和法规支持文件）用于监管审查，从而促进从研究到商业化的无缝过渡。
Gibco™ CTS™ AIM V™ 无血清培养基是首款商业化的、且成分明确的无血清袋装培养基，适用于T细胞和树突状细胞的增殖和/或处理，生产过程符合cGMP规范。
▲ Gibco™ CTS™ AIM V™ 无血清培养基
Gibco™ CTS™ 免疫细胞血清替代物用于添加入基础细胞培养基（如 CTS™ AIM-V™ 无血清培养基）以更好地支持多种人免疫细胞（如T细胞）的体外培养扩增。
▲ Gibco™ CTS™ 免疫细胞血清替代物
CTS™ TrypLE™ Select是由微生物发酵获得的一种重组酶，可用作猪胰蛋白酶的非动物来源替代品。该材料用于从塑料器具中解离贴壁依赖性细胞系。无论在不含血清还是添加血清的培养系统中，CTS™ TrypLE™ Select都能够解离培养的细胞。在从科研向临床应用过渡时，Gibco™ CTS™全线产品能够减少试剂验证方面的负担。
▲ CTS™ TrypLE™ Select重组酶
下一代CAR-T成药性分析
开发风险往往与候选药物的内在属性有关，因此，在进入过程开发之前进行成药性评估是至关重要的。成药性评价是用于系统评价候选药物的过程，包括结构评价、药代动力学（PK）和药代动力学（PD）、毒理以及可制造性评价等。
早期的成药性评估可以避免在后期开发过程中的延误，如果没有广泛的表征来了解选定候选者的生化和生物物理特性，意外的修改、稳定性或不良的PK和PD可能会导致项目进度延迟甚至终止。
与小分子药物已有简单成熟的成药性评价标准不同，CAR-T的成药性评价目前尚无类似的评价标准。从生物药的药物研发和生产的角度来看，可成药的生物药，除了需要具有低免疫原性、安全、高效的特点，还需要具有高稳定性、适合平台化生产等特征。最终能够产业化的CAR-T细胞必定是一个安全、有效的设计。真正将CAR-T推进商业化阶段，还需要解决其病毒系统生产成本高，工艺复杂，制备时间长等问题。
为此，选择封闭式自动化的细胞处理对后续大规模生产制造以及生产工艺的改进是非常必要的，可有效缩短细胞处理和分析的时间并提高效率。此外，自动化减少了人员接触，节省劳动力的同时也使跟踪过程更容易。
赛默飞开发的多功能Gibco™ CTS™ Rotea™逆流离心系统是一款模块化、封闭式的细胞治疗仪器，从研究到商业生产的各个阶段中都可使用，从而提高了效率并节省了成本。这款高度通用的系统，具有出色的灵活性。系统内置用户可编程的软件、大量细胞处理应用程序，以及用于从科学研究到商业化生产的实用程序。
▲ Gibco™ CTS™ Rotea™逆流离心系统
高成本效益慢病毒（LV）生产对于满足商业需求并平稳过渡到临床生产规模至关重要。为了满足这些需求，赛默飞创建了一套完整的慢病毒生产系统，以帮助降低成本并简化从研究到临床的过渡。
Gibco™ CTS™ LV-MAX™慢病毒生产系统是首套完整的悬浮液生产系统。与使用聚乙烯亚胺（PEI）的慢病毒生产方法相比，该系统产量可提高十倍之多，成本降低一半以上。
▲ Gibco™ CTS™ LV-MAX™ 慢病毒生产系统
下一代CAR-T安全性分析
细胞治疗产品的安全性研究评价应遵从《药物非临床试验质量管理规范》（GLP）。对于某些在非GLP状况下开展的研究或检测，应予说明并评估非GLP对试验结果可靠性、完整性及对细胞治疗产品总体安全性评价的影响。
CAR-T的安全性风险主要包括细胞因子风暴（CRS）、神经毒性、异体GVHD、致瘤性、脱靶效应等。
免疫毒性评价方面，为表征CRS风险，检测指标包括：血清细胞因子水平（IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、INF-γ、TNF-α等）。此外可根据使用动物模型不同，检测动物外周血中淋巴细胞技术及表型分析（CD3+、CD4+、CD8+等）；除此之外，还需观察GVHD，并进行免疫器官检查（重量、大体和组织病理检查）。致瘤性方面，可通过病毒载体插入人基因组的插入位点分析、体外细胞永生化增殖、体内研究中异常/异位增生性病变（如增生、肿瘤）等研究初步评估其致瘤性风险。
流式细胞术是分析由药物引起的免疫反应及细胞功能变化的关键方法。赛默飞高度智能化的流式细胞分析仪Invitrogen Attune NxT和配套试剂CellTrace™荧光染料，专为实现高效检测、节约实验时间而设计，为细胞及其功能分析提供全方位解决方案。
▲ 流式细胞术
细胞增殖染料稀释分析主要基于细胞膜通透性，荧光分子、染料进入细胞后，将会共价结合到蛋白质上的氨基上，从而使染料能够长时间停留在细胞中。CellTrace™荧光染料可用于在不影响细胞形态和生理特征的前提下，跟踪体内或体外的传代次数。
▲ 流式细胞增殖/杀伤活性试剂
下一代新型CAR-T研发与商业化整体解决方案
近年来，CAR-T细胞疗法已经在多种血液肿瘤甚至是实体肿瘤的治疗上展示出了令人鼓舞的结果与应用前景。随着国内CAR-T细胞工程化技术的不断进步，越来越多的创新T细胞疗法获批临床试验，相关监管法规也逐渐明晰。
在当前细胞与基因治疗创业热潮中，如何更快地实现从研发到临床应用与商业生产的转化成为了CAR-T细胞疗法赛道上致胜的关键点。然而将研发成果推向市场是一项艰巨的工作，面临着法规监管、工艺放大、稳定性和一致性、风险控制等诸多方面的挑战。
医麦课堂携手赛默飞，将在2021年第2季度上线“解码细胞免疫治疗，鼎力现在与未来”系列线上专题讲座，届时欢迎各位在线交流学习！第3期课程将在5月20日晚20:00上线，由上海邦耀生物科技有限公司副总裁 张楫钦、赛默飞细胞与基因治疗产品技术专家 周静，带来《下一代新型CAR-T研发与商业化整体解决方案》的精彩分享。
参考资料：
1.Hong, M., Clubb, J. and Chen, Y., 2020. Engineering CAR-T Cells for Next-Generation Cancer Therapy. Cancer Cell, 38(4), pp.473-488.
3.Stadtmauer, E., Fraietta, J., Davis, M., Cohen, A., Weber, K., Lancaster, E., Mangan, P., Kulikovskaya, I., Gupta, M., Chen, F., Tian, L., Gonzalez, V., Xu, J., Jung, I., Melenhorst, J., Plesa, G., Shea, J., Matlawski, T., Cervini, A., Gaymon, A., Desjardins, S., Lamontagne, A., Salas-Mckee, J., Fesnak, A., Siegel, D., Levine, B., Jadlowsky, J., Young, R., Chew, A., Hwang, W., Hexner, E., Carreno, B., Nobles, C., Bushman, F., Parker, K., Qi, Y., Satpathy, A., Chang, H., Zhao, Y., Lacey, S. and June, C., 2020. CRISPR-engineered T cells in patients with refractory cancer. Science, 367(6481), p.eaba7365.
4.https://bioraylab.com/xbziliao_a.html
5.http://www.crisprtx.com/programs/immuno-oncology