新势力-ABclonal&YUROGEN兔单克隆抗体技术平台助力治疗性抗体应用丨医麦猛爆料
2021年7月1日/医麦客新闻 eMedClub News/--世界卫生组织国际癌症研究机构（IARC）发布的最新癌症数据显示，未来20年内癌症的形势非常严峻，预计全球癌症患者可能会增加60%。高速发展的生物医药技术正承载着改变未来的希望：帮助癌症患者揭示患癌机制，同时提供强有效的治疗方法。治疗性抗体药物特异性结合肿瘤靶标，疗效显著，已经成为生物医药的重要组成部分，在疾病治疗上具有广阔的应用前景。
为了满足市场日益增长的兔单克隆抗体需求，ABclonal全资子公司Yurogen Biosystems开发了全球领先的基于单B细胞的第四代兔单克隆抗体筛选技术平台-SMab™ Platform，用于研发和生产兔单克隆抗体。到目前为止，我们已经为国内外大型生物制药公司、临床诊断试剂开发企业和众多的科研院校等开发了1000余个兔单克隆抗体项目。
兔单克隆抗体简介
图一 CD40肿瘤免疫调节原理
Apexigen公司基于兔抗人CD40单克隆抗体改造而成的APX005M全人源化单抗，在肿瘤免疫治疗方面体现出了极佳的效果，引起了业界的广泛关注，并已进入了II期临床试验。ABclonal联合YUROGEN，依靠SMab™平台，也开展了兔抗人CD40单克隆抗体初步开发：用人CD40重组蛋白免疫兔子之后，利用SMab™平台尝试性的筛选了1152个单B细胞克隆，经培养后筛选获得431个ELISA阳性克隆（阳性率37%）；选取了147个ELISA阳性克隆，利用其细胞培养上清进行了报告基因实验，筛选获得26株克隆具有CD40分子激活功能（部分数据见图二）。
图二 功能性兔单克隆抗体筛选
图三 功能性人/兔嵌合型单克隆抗体筛选
通过分子克隆扩增获得该26株克隆的抗体可变区基因，并快速组装人/兔嵌合型单克隆抗体，经表达纯化后，通过人外周血淋巴细胞来测定其对树突状细胞的激活功能，显示（部分结果见图三）大部分嵌合抗体对树突状细胞具有较强的激活能力，主要表现在CD86和MHC II两个细胞表面分子有显著提高。
案例2 兔抗新冠病毒中和抗体开发
YUROGEN（ABclonal全资子公司）联合南京市鼓楼医院、江苏省疾控中心等单位，在Emerging Microbes & Infections（EMI，新发微生物与感染）杂志上发表了Potent RBD-specific neutralizing rabbit monoclonal antibodies recognize emerging SARS-CoV-2 variants elicited by DNA prime-protein boost vaccination的论文，首次报道了利用DNA免疫结合蛋白增强免疫的策略成功开发兔源性抗新冠病毒中和抗体，并对目前主要新冠病毒突变株显现出一定的广谱中和活性。
该项目首先利用基因枪技术对实验兔进行DNA免疫，然后再使用新冠全长S1蛋白进行增强免疫；经过7周左右的免疫流程，免疫后动物显示出对新冠刺突蛋白（S1蛋白）较强的血清抗体滴度（图四）。
图四 兔多抗血清检测
然后，YUROGEN利用其独特的单细胞筛选和培养平台，从免疫后兔子中分离获得的脾脏细胞，进行抗原特异性的分选；我们只使用了约1/10的脾脏细胞（约3000万细胞），分离获得了1152个抗原特异性B淋巴细胞。对这些B淋巴细胞进行短暂培养之后，利用其培养上清我们进行了ELISA实验和假病毒中和实验，结果显示：在1152个培养细胞中，获得了350个针对S1蛋白的ELISA阳性克隆（OD450均高于阴性对照5倍以上），ELISA阳性率高达30%；其中，具有假病毒中和活性的克隆达62个。有趣的是，在这62个潜在的具有中和活性的克隆中，仅23个能够阻断RBD和ACE2的结合。
经过对初步筛选获得的ELISA数据和假病毒中和活性数据的比较，以及各潜在中和抗体克隆对于不同新冠突变株S1蛋白的ELISA结合活性，我们选取了4个克隆，在鼓楼医院的协助下测试了其针对各突变株假病毒的中和活性。结果显示：选取的4株抗体针对不同的突变株新冠病毒都具有一定的中和活性（图五A），其中克隆1H1显示对各个主要突变株均具有较强的中和能力，其抑制的IC50都在纳克级水平；并且中和活性的检测结果，和ELISA结合实验结果基本相符。根据其对假病毒中和活性，我们又选取了1H1和9H1两株克隆，委托江苏省疾控中心进行了真病毒的中和活性，证实了该两株抗体对新冠病毒具有强大的中和活性（图五B），其抑制的IC50在分别为136ng/mL（克隆1H1）和26ng/mL（克隆9H1）。
图五 新冠病毒中和活性验证
综上所述，我们可以看到：首先，利用DNA免疫结合蛋白增强免疫，可以在动物体内有效的激发抗体滴度，在实际抗体开发过程中，这个策略可以解决免疫原蛋白较难获得或者构象不一定正确等问题；其次，基于单细胞筛选和培养的单克隆抗体开发平台，完全颠覆了传统的杂交瘤细胞平台，不仅仅能够获得较高的筛选阳性率，而且能够利用B细胞培养上清快速进行一些功能实验，锁定功能性单克隆抗体，减少后期开发的时间、工作量和风险；最后，在这个案例中，兔单克隆抗体亲和力强和多样化程度高等特点，得到了完美的体现。
案例3 抗独特型抗体开发-在抗体药开发中的应用
近年来，由于抗体药物的快速发展，抗独特型抗体由于其均一性好、特异性强等特点，使之成为在药物代谢学和药物动力学（PK/PD）方面研究不可缺的检测试剂，比如广泛用于动物和人血清中抗体药含量和状态的测定。
在药物发现阶段，可以开发抗独特型多克隆抗体，甚至于利用抗原捕获的方法，对药物含量进行初步的检测。而到了临床前和临床实验阶段，需要对抗体药在体内的药动和药代学进行研究，此时一般推荐使用均一性好、特异性强、亲和力高的单克隆抗体。同时，抗独特型抗体还可以在抗体药的开发中作为阳性对照使用。
传统型的单克隆抗体药物一般为双链的全人源化IgG结构，因此只需要针对其Fab上面的独特型区域，开发一对抗独特型单克隆抗体，包括抗原结合阻断型和非阻断型单克隆抗体，用于夹心法酶联免疫检测方法试剂盒的开发。
图六 抗独特型抗体开发
ABclonal/YUROGEN为国外知名制药公司，从Fab免疫原的制备开始，开发了多对针对Covid-19中和抗体药物的抗独特型抗体。首先，我们帮助客户对其提供的单克隆抗体药物进行酶切、并利用FPLC纯化Fab片段（图六A）；然后利用ELISA的方法，建立了单克隆抗体药物和其靶点蛋白的结合曲线并计算获得IC50（图六B）；我们对免疫后的动物血清进行了滴度分析和阻断抗体比例分析（图六C）；经过63天的免疫后，动物体内的血清滴度完全达到了进行单克隆抗体开发的要求，我们即利用SMab™平台进行单B细胞筛选，依照常规流程，筛选了1192个单B细胞，经培养后对其培养上清进行ELISA筛选，总共获得了382个与单克隆抗体药物结合的阳性克隆（阳性率达20%）；进一步分析获知没有一个和Fc片段结合（即脱靶率为0），其中160个克隆具有阻断抗体和抗原结合功能，222个克隆不能阻断抗体和抗原结合功能；最终从中选择了5个克隆（2株I型，3株II/III型）进行基因克隆和重组表达，最终经ELISA验证其结合活性和阻断活性（图六D）。
案例4 高特异性EGFR-L858R病理诊断抗体开发-伴随诊断抗体
图七 EGFR-L858R病理诊断抗体开发
肺癌是威胁人类健康和生命的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率在近年来明显增高，尤其是男性的肺癌发病率和死亡率均占所有恶性肿瘤的第一位。其中非小细胞肺（NSCLC）癌约占所有肺癌的 80%。在非小细胞肺癌患者体内,表皮生长因子受体（EGFR）的突变最为常见，其中约 30%-40%的亚洲 NSCLC 患者在确诊时携带 EGFR突变。目前，临床EGFR基因突变的检测以组织检测为首选，病理诊断在肿瘤检测、疗效检测及预后判断等方面具有显著优势。通过SMab™技术平台开发EGFR-L858R病理诊断抗体，筛选1800个单B细胞克隆，经过ELISA筛选后获得158个针对抗原特异性的B淋巴细胞，从中随机选取10个克隆，经分子克隆表达之后，最终经病理证实其能够特异性识别内源性靶点蛋白（部分数据见图七）。
走进ABclonal&Yurogen
ABclonal（武汉爱博泰克生物科技有限公司）成立于2011年，作为生命科学解决方案的提供商，旨在为更多的科研工作者、IVD企业、新技术开发企业提供抗体、酶、NGS产品和蛋白制品等全套解决方案。ABclonal现有波士顿抗体与蛋白研发中心、上海诊断与科研分子酶产品研发基地以及中国武汉光谷诊断与科研免疫产品生产和研发基地。经过多年的深耕与发展，ABclonal已拥有免疫与分子酶两大技术平台，集新型分子酶、全领域应用NGS建库解决方案、新平台单克隆抗体与高活性蛋白制品的研发与生产于一体。ABclonal致力成为产业科研转化的核心企业，向生命科学研究工作者和应用企业提供全套可靠的技术解决方案。
Yurogen（优睿赛思生物科技有限公司）是ABclonal（武汉爱博泰克生物科技有限公司）全资子公司，于2015年成立于美国波士顿，并于2018年在武汉光谷设立优睿赛思（武汉）生物科技，服务于亚太市场。优睿赛思（Yurogen）生物科技主要利用拥有独立知识产权的基于新一代单B细胞筛选和培养的单克隆抗体开发平台（SMab™平台），专注于为全球各大型制药公司、生物技术公司和临床诊断试剂开发企业提供高品质的单克隆抗体前端开发和诊断原料单克隆抗体开发的各项CRO服务。高通量的SMab™平台在保证兔单抗的多样性的基础上，能快速高效筛选出高亲和力和高特异性的重组兔单抗，全面超越杂交瘤单抗技术，在CRO市场获得了客户充分信赖并广泛认可。
着眼未来，ABclonal&Yurogen将面向国内和国际市场，将领先的兔单克隆抗体开发技术应用于实践，助力合作伙伴一起研发出更多First-in-Class和Best-in-Class抗体产品，以生物技术解决更多健康挑战，为人类生命健康做出更多贡献。
联系方式：王经理13761297570 网址：https://abclonal.com.cn/