2021年7月14日/医麦客新闻 eMedClub News/--2006年，日本京都大学的山中伸弥（Shinya Yamanaka）团队在Cell上率先报道了关于诱导多能干细胞（iPSC）的研究，自此开启了干细胞治疗的一个崭新的分支。在过去的十五年间，iPSC迎接过许多机遇，也面临着一些固有的挑战。
多能干细胞（Pluripotent Stem Cells, PSC）是一种可在体外无限扩增，并能分化为所有三个胚层的细胞，这两个特性使其成为细胞疗法最适合的细胞来源。多能干细胞的代表包括胚胎干细胞（Embryonic Stem Cells, ESC）和诱导性多能干细胞（induced Pluripotent Stem Cells, iPSC）。2006年，山中伸弥及其团队提出假设，认为ESC中存在的定义因子可以在体细胞中诱导其多能性，并基于该假设在小鼠 ESC中寻找重编程因子，成功确定了能够在小鼠胎儿和成人成纤维细胞中诱导多能性的四个因素——Oct3/4、Sox2、Klf4 和 cMyc，最后将这种新型多能干细胞命名为诱导多能干细胞。较之胚胎干细胞，诱导多能干细胞在形态、基因和蛋白表达、表观遗传修饰状态、细胞倍增能力、类胚体和畸形瘤生成能力、分化能力等方面都与胚胎干细胞相似，同时又避开了胚胎干细胞的伦理问题，在疾病模拟、药物筛选和细胞治疗中有着巨大的应用前景，被人们视为细胞疗法的新希望。在2012年，山中伸弥也因在iPSC领域的开创性研究获得了当年的诺贝尔生理学或医学奖。此外，iPSC体外培养时如果通过构建合适的环境，如添加生长因子、设计生长基质等，模拟体内发育过程，理论上可分化成任何成体细胞与器官类型。基于这些显著的优势，iPSC因此成为培育类器官重要的细胞来源。1.由于可以直接来自成人的成熟分化细胞（常见皮肤细胞等），相对于ESC更具可预见性，不必担心其分化后成体健康状态问题。3.可以通过诱导分化无限培养，细胞株数量不受限制，可降低成本并保证细胞一致性。4.无需从胚胎提取，来源更便捷，同时避开了伦理问题。虽然已经过去15年，但是iPSC的产业应用实则尚属早期阶段。阻碍iPSC迅速转化到临床和市场的，一方面是其制备环节的考虑因素，另一方面是其固有的一些特性带来治疗中的安全性问题。对于自体iPSC来说，细胞的高纯度提纯和临床使用的细胞选择方法依然存在时间和经济上的巨大成本挑战。加利福尼亚大学的研究人员Hans Keirstead说：“通常我们要2个月的时间建立细胞系，几个月的时间放大，在几个月的时间去让iPS细胞分化到我们想要的细胞，然后在几个月放大，最后用大半年的时间测试细胞不会形成肿瘤。而且这一切必须在‘良好作业规范’（GMP，good manufacturing practice）下进行，这又大大增加了成本。”此外，市场监管和制备工艺尚未形成较成熟的产业链。大部分iPSC还处于科研阶段，对临床级别应用所需的细胞诱导、培养、生产、制备等方面的硬件和软件的能力尚不成体系，也会导致细胞的制备难以标准化。加上目前市场上依然存在许多未经获批的所谓“干细胞”产品，监管力度仍需继续加强，产品的质控也需要继续规范化。
山中伸弥教授发表在Cell Stem Cell上的Pluripotent Stem Cell-Based Cell Therapy—Promise and Challenges中提到，致瘤性、免疫原性和异质性这三个iPSC细胞的固有特性同时也是iPSC细胞应用的三大挑战。
致瘤性其实与iPSC的增殖潜力源自一体。iPSC无限增殖的潜力使其能够为患者移植准备数十亿种不同类型的人体细胞，但是如果细胞在移植后继续进行过度增殖，就有可能导致肿瘤形成。2013年日本进行首例人体移植iPSC衍生的视网膜色素上皮细胞的临床试验后，同一团队开展的第二例手术却突然被主动叫停。2015年，山中伸弥对原先招募的第二例患者所培养的iPS细胞分析做出报告，显示有六个基因突变。三个基因被删除，三个是基因序列发生变化，包括了一个与癌症相关的基因。虽然该基因突变不具直接致癌的危险性，但研究团队决定不将该细胞移植回患者身上。1. 未分化和/或未成熟的细胞保留在从人类 PSC 分化的最终细胞产物中，则可能由于错误复制而出现畸胎瘤或肿瘤。该种原因造成的影响将是最严重的；2. 如果重编程因子在iPSC中依然保持活性，则可能会促进肿瘤产生；3. 其PSC在体外培养的过程中可能发生基因突变引起肿瘤。
目前针对该问题的解决方法需要建立有效的体外定向分化方法，精细检测为分化细胞的标志物是否呈阳性，保持更加严格的纯化程序。此外，在iPSC系的选择上也需谨慎选择，其致瘤性可能不同。再者，例如用于维持重编程因子游离表达的EBNA1已被证明有致瘤风险，应该在临床细胞疗法中小心排除这些致癌转基因。虽然多能干细胞都具有多能性和无限增殖性，但是不同细胞系之间的多能干细胞在形态、生长曲线、基因表达和分化成各种细胞谱系的倾向方面都各不相同。因此，这种异质性会给下游应用带来障碍。在小鼠中早已发现，只有来自特定的129个菌株的小鼠所提取的mESCs，其制造嵌合小鼠并进行种系传递的能力较好。遗传变异和表观遗传修饰的结合是造成异质性的原因。 在人类iPSC中，遗传背景是确定基因表达异质性的最大因素。为了克服异质性，一些研究人员试图将hPSC的“启动”状态转换为“初始”状态。为了解决异质性文明同，研究人员将多能干细胞由启动状态转化为“基态”。目前已有多种方法被报道用来诱导多能干细胞的“初始”或基态多能性，其中包括结合使用生长因子的化学抑制剂组合。不过该技术目前上不成熟，其转化得到的初始人类干细胞（naive hPSC）可能导致过速增殖，少数情况还可以发生染色体异常。另一个问题是会造成印记丢失。初始人类干细胞的一个特征是整体低甲基化，在重新分化到启动状态时将被重新甲基化，然而大多数印记基因在重新启动的细胞中会被抹去，这种异常印记可能阻碍其临床应用。免疫排斥是任何细胞治疗中都不可避免的一个关键问题。虽然自体 iPSC 的低免疫原性最终得到了研究的证实，不过在目前的iPSC项目中，实际上是同种异体的“现货”iPSC占了主流。因为同种异体iPSC移植不仅可以解决制备成本的问题，同时也可以提前制备以快速满足一些急性疾病患者移植的需求。但是，这也就带来了更大免疫原性的问题。克服免疫排斥的传统方法是使用免疫抑制剂。不过在造血干细胞移植中，目前广泛应用的方法是HLA单倍型匹配，可以减少免疫抑制剂的剂量和使用时间。人体白细胞抗原（HLA）的特异性是异体器官移植或细胞治疗时产生免疫排斥反应的主要原因。人群中存在一些特殊的个体，他们的HLA基因5位点为高频单倍体的纯合子，来源于这些供体的细胞在细胞移植时能覆盖高数量的受体人群，因此也被称为“超级供体”。HLA单倍型匹配是通过从捐赠者中筛选出这样的纯合子捐献者，获得同意后采集其血样用于iPSC制备，使细胞的HLA单倍型能被提前确定。脐带血库中的冷冻血液样本也可以使用。所以，建立一个“超级供体”干细胞库就成为了同种异体iPSC发展的必要支持。国际上，日本、美国、欧洲、韩国等均已建立覆盖人群范围较广的超级供体iPSC库。日本的iPSC库相对较完善，可覆盖约85%日本人口的受体人群，细胞数量大于75株，同时向日本各机构授权使用以开发相关药物。2018年3月，我国首例中国人群“超级供体”诱导多能干细胞株制备完成，可覆盖至少3600万中国人群。未来若可达成国际间“超级供体”干细胞库的合作，将有可能减少种族、地域性特征等因素的干扰，覆盖更广泛的人群。近年来，随着基因编辑技术，尤其是CRISPR技术的发展，HLA单倍体匹配的方法也进一步发展出了HLA隐藏（HLA cloaking）这一新的免疫抑制方法。例如，通过删除其通用组件B2M基因，Ⅰ类MHC（包括HLA-A/B/C）将失活不表达。然而，缺失Ⅰ类MHC将导致NK细胞的“丢失自我”（missing self recognition），使iPSC细胞被裂解。研究人员通过引入HLA-E和B2M解决了NK细胞激活的问题。因此，目前认为一个人类iPSC系细胞如果删除了B2M基因并引入了HLA-E-B2M，则可以作为适用于所有受体人群的通用细胞系。
▲ HLA隐藏示意图（图源：文献）
HLA单倍型匹配和HLA隐藏各具优劣。HLA单倍型匹配无需基因编辑，没有脱靶效应，但在降低异质性和降低成本方面，HLA隐藏更胜一筹。
第一个使用iPSC的临床试验开始于2008年，到2020年，算上疾病模型中的应用，使用iPSC的临床试验的数量已经上升到超过50个。了解更多详情，扫描二维码进行完整阅读
纵观整个生物制药领域，iPSC的临床应用虽然在技术上尚不完备，但依然是一颗冉冉升起的新星。中国的iPSC细胞赛道并不落后于世界，甚至包含一些国际领先的研究和产品。未来在制度、监管、工艺、材料等各方面进一步的成熟下，期待iPSC治疗能真正落实到市场上。
1.DOI:https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.09.0142.https://mp.weixin.qq.com/s/VJwiwEUp7f_A62Fylq15Kg医麦客始终致力于生物创新药的前沿技术、行业动态、产业洞察等原创新闻报道，全媒体高端矩阵用户达16万+，其中工业用户占比超50%，科研与临床用户约为30%，投资机构用户超过5%。为促进产业细分领域的互动交流，我们组建了多个专业微信群，欢迎扫码加群。