独家盘点：全球主流封闭式细胞治疗处理系统
2021年8月24日/医麦客新闻 eMedClub News/--细胞与基因治疗作为新型生物制药领域的热门方向，有许多的企业投身于研发、试验、生产、转化等等。而在这之中，从最近万众瞩目的CAR-T疗法，到曾获诺奖的诱导干细胞，再生医学领域内的前沿技术都逃不开最基础的操作：细胞的获取和培养。然而，要获得足够安全且高活性的目标细胞，并不是一件简单的事。随着细胞与基因治疗领域的飞速发展，研究者与生产企业对硬件设施的技术要求也在不断提高。
近日，ISCT官方期刊Cytotherapy上发表了一篇题为“Advances in automated cell washing and concentration”的文章，对目前再生医学市场中细胞洗涤与浓缩步骤的制备生产过程进行了综述分析，并对未来的发展方向做出了推测。
再生医学与先进疗法的医药产品（ATMPs）包括基因治疗、细胞治疗和组织工程产品。随着越来越多的ATMPs准备或者已经进入市场，ATMP的受众也越来越广泛，其制造规模也随之增加，带来新的重大挑战。
为什么选择自动化封闭式细胞治疗处理系统？
1）自动化的封闭式细胞处理设备可以在极大程度上降低污染风险
在研究实验室环境中，细胞洗涤和浓缩等步骤通常使用台式离心机完成，然后重复进行手动移液，来获得最终的细胞悬液。虽然手动过程的部分也可以在符合GMP要求的生物安全柜中进行，但是打开和关闭容器盖的操作会带来很高的污染风险，尤其是操作涉及多个培养容器时，污染风险更甚。通过自动化的封闭式细胞处理系统，将分开的多个步骤整合至一个设备中，由此减少了处理的步骤次数与无菌边界之间相互接触的数量，以此来降低污染风险。
2）封闭式处理系统或可更有效利用空间
由于将多个设备整合到同一设备中，自动化的封闭式细胞处理系统往往体积不大，可以在保证低污染风险的同时，降低占地空间，这样能够更有效地利用洁净室的面积，也侧面可节省成本。
3）封闭式细胞治疗处理系统可以进行模块化管理，按产品进行定制
这种设备并不是将多个步骤整合为一个步骤，因此可以对不同步骤进行模块化管理，随时按照生产需求进行模块修改，也就可以按照客户需求定制最适合其产品的工作流程和平台选择。目前使用最广泛的模块化设备类型之一就是细胞洗涤浓缩处理平台。
4）对操作员工的要求更低，降低对GMP规范要求的培训，减少了人工成本
全自动的封闭式细胞治疗处理系统通常会配备有直观的程序软件，以便用户操作、设计和管理。同时，因为无需操作人员直接处理细胞，也就减少了对员工操作的培训成本，使生产过程更便捷。
选择自动化封闭式细胞洗涤和浓缩设备时的考虑因素
目前市面上已经有多款自动化封闭式细胞治疗处理系统可供选择，但是各有优劣。同时，不同的细胞治疗产品也有着不同的需求，想要构建一个最适合产品的自动化流程链，需要对产品的技术和设备的技术都有深入的了解。
▲ 选择设备时的一些参考因素（图源：文献）
1）从细胞来源的角度而言：
细胞的来源可分为自体细胞和同种异体细胞产品，这二者对生产加工的核心需求是不同的，如细胞数产量、活性和细胞浓度等，因此对设备的选择也不同。
洗涤和浓缩的步骤可发生在细胞富集过程的初始步骤，也可应用于中间过程来改变介质或在制备结束时来浓缩细胞悬液，最后用于产品配方和灌装。
对自体细胞产品而言，设备的最小处理量和活细胞回收率的能力是重点考虑的因素。较低的活细胞回收比例会导致最终这一细胞治疗产品生产失败。而当制备浓缩的细胞悬浮液时，最小输出量也是制备能否顺利进行的关键。
例如，当通过电穿孔法制备CAR-T细胞产品时，细胞浓度需要保持在40-300x10^6个细胞/mL。通常情况下，对于单采来说，一个细胞洗涤装置需要能够将收集的产物浓缩至体积小于10mL，才能适用于电穿孔。而目前只有少数封闭性细胞治疗处理设备能达到这一要求（如Rotea、Sepax、Ekko等）。
此外，部分产品还需要具有细胞分选功能的自动化设备。例如，来源于血液成分的ATMP还需去除红细胞或者从中分选所需细胞。Rotea、Lovo、Sepax、Elutra等设备不仅可以交换缓冲液来洗涤细胞，还能同时去除红细胞，在同一步骤中实现更多处理，从而最大限度降低工艺开发成本。
对同种异体细胞产品而言，最大处理量才是较重要的因素。主要考虑的是起始材料的输入体积范围。对于同种异体产品而言，其起始材料的体积可小到50mL（如脐带血来源），进行细胞扩大培养后体积可大至1000L。所以对设备的体积处理量要求较高。
影响洗涤和浓缩设备选择的另一个关键因素是处理速度和时间。任何对细胞质量的负面影响（例如剪切应力）都可能会在下游设备处理中被放大。另外，转染、转导、酶消化或细胞分选等过程都会给细胞施加压力，使其对洗涤和浓缩的操作更加敏感，不易控制。
不过，鉴于处理速度可能会因每次制备时培养基的组成和细胞密度的不同而改变，或许只能通过在正式生产制备前先对样品进行洗涤浓缩，来帮助确定后续生产的条件设置。在高密度的细胞悬浮液（>5x10^5个细胞/mL）中，细胞可以形成细胞簇并从悬浮液中分离，基于声学的设备可以更高效地处理这样的悬浮液。相比之下，以过滤为原理的设备（例如Lovo）则受到最小输出量的限制。
2）从设备角度而言：
可整合性是自动化封闭式细胞治疗处理系统的核心价值。自动洗涤和浓缩设备作为加工链的一部分，是以模块化的方式与其他设备进行物理连接，这其中如何规划和评估设备的互相连接方式是十分重要的。
如果试剂是包装在袋子中，则洗涤和浓缩装置的设置方式可能很简单。因为包装袋可以和几乎所有设备兼容，在管道尺寸合适的情况下，通过尖刺的端口或者无菌焊接连接即可。但如果是采用了其他形式的包装，需要增加一个将材料先转移到袋子中的步骤，再进行无菌连接和洗涤浓缩的。所以，如果这次转移不能实现无菌连接，则自动化设备消除污染风险的价值将大大降低。理想状态下，浓缩后的产品也应该通过封闭设备转移到下游的流程中（如制剂和分装）。
此外，设备的占地面积和移动性也是考虑因素之一。洁净室空间通常是有限的，而可移动的设备增加了便利性，不同房间中移动无需重新校准，降低了制备的复杂程度。
再者，软件集成也是封闭式细胞处理系统的重要组成。集中的电子记录使操作可以自动化，能够取代批次间生产和质控的手动记录。此外，匹配的控制软件还可以扩展到应用同一集中式系统的多个设备上，这样可以控制所有连接的设备并提供实时反馈。目前，软件辅助控制流程自动化还仅限在同一制造商的设备上应用。若要开发定制系统，那么从不同设备提取加密数据将成为一个挑战，并且需要大量投资研发。
3）从流程设计角度而言：
工艺开发的目标是开发一种稳健的、可重复的工艺，该工艺可扩展用于临床生产，同时保持产品质量，并满足监管要求。一种稳定、合适的洗涤和浓缩工艺应该做到不随材料的变化改变其生产的稳定性。
要开发这样一种工艺，需要大量的努力来确定和控制过程的关键工艺参数，重复的多变量分析有时是必不可少的。例如，基于离心的过程的关键过程参数可能包括流量速度、离心速度和沉降时间。优化这些参数时，应考虑工艺参数与产品质量之间的关系，以确保制造工艺适合规模化生产。
对于细胞内部一致性较低的产品（如自体细胞产品），还可以开发预测算法来指导制造步骤，以实现所需的产品轮廓。
开发的过程还应考虑成本问题。除了设备本身的资金投入，应注意的是，选择不完全合适的设备可能会增加额外的成本。
目前市场上的部分全自动封闭式细胞治疗处理系统
赛默飞依托其卓越的生命科学试剂和分析仪器平台底蕴，构建了封闭式、模块化和自动化的CTS细胞治疗端到端生产平台，Gibco™ CTS™ Rotea™ System是CTS细胞生产平台中关键的工艺设备。该系统由一台小巧的多功能主机、一次性使用无菌套件，以及直观、可视化、可定制程序的软件组成。它们共同构成了一个封闭式细胞处理系统，可以高效、灵活地进行细胞的分离、浓缩、洗涤、缓冲液置换和冻存，旨在帮助细胞治疗产品从实验室研发环节转化到临床试验、乃至商业化生产中。
该系统使用逆流离心技术，细胞输入口设置在离心室内。
可连续处理范围广泛的输入体积，输出体积可低至5ml，高浓度的输出产物中仅包含极少量缓冲液或溶液残留，适用于电转，自体细胞产品的商业化生产。
能够清洗和浓缩小于50ml的细胞样品，处理时间小于15min，且能够维持细胞活率高达100%。这是一款从临床前研究过渡到商业化生产都可使用的逆流离心的设备。
在细胞的处理过程中还可以同步去除红细胞等干扰，减少操作步骤。
无需Ficoll或ACK，即可实现去除粒细胞（影响T增殖）和降低单核细胞占比。
温和的流化床可实现低剪切力处理，能够在保持细胞活性和高速度的同时实现超过95%的细胞回收率。
Rotea系统还配有摄像头，提供实时的可视化信息，便于用户随时观察和调整，便于工艺优化流程。
通过可定制的自动化程序软件，该系统可以进行模块化的改装，按照需求定制生产的流程。
Gibco™ CTS™ Rotea™ System不但能够与赛默飞其他设备像Xenon电转仪，摇摆式生物反应器Rocker等组合成CTS细胞生产平台，而且也能与市面上的其他工艺设备比如细胞工厂， G-Rex培养瓶实现工艺衔接。赛默飞也在CTS细胞生产平台基础上开发一种数字化软件解决方案，以提供与DeltaV平台（DeltaV是一个在生物生产和制药行业广泛使用的自动化系统）的直接连接，实现全自动过程管理和细胞工艺数据完整性与追溯性。
CliniMACS® Prodigy是由Miltenyi Biotec公司在美天旎成熟的磁珠分选MACS®技术和CliniMACS® Plus系统基础上开发出的一款集合细胞分选、细胞离心、清洗和细胞培养等多种功能于一体的全自动细胞处理系统。新的CliniMACS Prodigy®平台提供用于精简的高级集成解决方案细胞处理工作流程：从细胞分离，通过细胞培养，形成最终的产品。其核心离心技术为密度梯度离心，可自动检测淋巴细胞分离白膜层，并进行分层，还可以分离血液中的血浆、白细胞、红细胞等成分。
全自动化的分选流程，全封闭的管路系统，避免人为操作失误和污染风险，提高效率
整合MNC分离，磁珠分选、病毒转导，小规模细胞培养，细胞浓缩、换液流程
培养体积在50~640mL，最终总细胞数3.8×10^9个，对于大体积的治疗工艺如TCR-T细胞、TIL等的实体瘤及异体细胞治疗有一定受限
机时利用率有待优化，以更好利于产业化规模扩展，单台设备推荐产能20例/年
制剂功能和分装功能待提升
Cytiva(前身为GE医疗集团生命科学部)的Sepax和Sefia系统来自于Biosafe Group SA。Biosafe Group成立于1997年，活跃于自动化细胞处理系统的设计、制造和市场营销。2016年7月13日，GE 医疗对外宣布收购了Biosafe Group SA。
Sepax系统的产品包括Sepax2和Sepax C-Pro，后者是在前者基础上更进一步更新开发而来的。Sepax系统均是基于Biosafe Group的轴向离心专利技术，Sepax C-Pro细胞处理系统可用于多个细胞处理的步骤，支持安全、可再现、标准化的程序。主要特点有：
自动化、封闭式，可处理体积范围一般为50~1200mL
终体积控制8-500mL±5ml
功能涵盖：①通过去血浆的方式浓缩单采血中的白细胞；②从单采血中去除血小板，从而浓缩白细胞；③密度梯度离心法富集单个核细胞；④细胞和磁珠孵育，并清洗；⑤病毒转导；⑥稀释、浓缩和洗涤细胞；⑦稀释和分装细胞产品到多个终产物袋中。
Sefia S-2000细胞处理仪是Cytiva推出的大体积连续流细胞处理系统，Sefia S-2000细胞处理仪结合PremierCell Sefia协议软件和CT-300.1 Sefia细胞分离套件，可以从多达880ml的单采产品中分离细胞；若配合FlexCell Sefia软件和CT-800.1 Sefia细胞分离套件，则可以收获高达10L的扩增细胞。
封闭式管路系统（通过无菌接管实现）
最大处理体积21L
全触摸屏面板，全自动处理，免人工看管
不能分离红、白细胞，主要用于细胞洗涤
终产品有最小体积限制（＞50mL）
适配的软件和功能较相对简单
AXP® II系统是一种脐带血处理系统，旨在与ThermoGenesis提供的特定且兼容的一次性分离套件结合使用，供实验室使用。AXP II系统允许在封闭和无菌环境中快速、自动化和可重复地分离脐带血。系统包括AXP II设备、AXP II扩展坞、AXP加工袋套装、XpressTRAK软件和相关配件。
该系统可以收集血沉棕黄层、红细胞和血浆等组分，活CD34+干细胞回收率大于97%，高于其他可用系统。此外，用AXP处理的脐带血单位(CBU)比具有相似总有核细胞(TNC)的常规处理单位含有更多的单核细胞(MNC)，血细胞比容在最终储存量中始终小于30%。
X-WASH是一种简单但功能强大的基于沉淀的系统，允许将细胞样品受控分离、洗涤和减少体积到新鲜培养基中。PXP系统则是一种用于临床的自动化封闭式骨髓细胞处理系统，可以减少最终骨髓浓缩物中的红细胞污染，同时保持高浓度的造血干细胞和祖细胞群。除了保持对CD34+干细胞和MNC的高回收率之外，该系统还可以在不到20分钟的时间内快速浓缩骨髓，红细胞消耗率超过98%。
2021年2月，该公司向FDA提交了其更新的PXP-LAVARE系统的备案。PXP-LAVARE系统是符合GMP的自动化细胞处理系统，可以快速、自动化和可靠地清洗和重组细胞悬液，设计用于与PXP-1000系统一起使用。PXP-1000系统是用于下游cGMP合规的细胞疗法临床制造的一种医疗设备，可用于CAR-T细胞的临床用生产。
PXP®系统主要优点是实现大于98%的红细胞去除率。但最大缺点是需要依赖离心机才能完成细胞处理，相比其他细胞处理系统的人力操作介入比较多。
Cocoon系统是一个自动化、封闭式的单一系统，以帮助开发用于自体细胞治疗生产，可通过模块化设计用于多种不同的自体细胞的活化，增殖和收集等处理，包括CAR-T、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)和间充质干细胞(MSC)等。
2018年Lonza收购Octane80%的股权后，对Cocoon系统进行了重大改进。改进后的Cocoon平台提高了其系统的稳健性，并通过所有的监管、安全和质量要求，扩大生产，并获得了欧盟CE标志以及DMF递交等，使其能应用于商业销售和临床生产。此外，该系统还基于Lonza Nucleofector系统，添加了整合式磁性细胞分离和整合式细胞电转。
Cocoon平台还可对温度、气体、pH和DO进行监测；通过集成的4°C冷室进行细胞培养；可预加载过程试剂；信息记录和控制，以实现数据可追溯性。该平台目前已与部分临床试验展开合作。
CellSep Pro是一款用于PBMC外周血单核细胞分离的全封闭自动化细胞处理系统，其分离原理和Sepax相似，均采用轴向离心原理，可通过预设的工艺程序，实现细胞分离、细胞复苏、细胞浓缩洗涤、细胞分装等。
PBMC分离程序的起始血量最低可至30mL，最高达150mL，细胞洗涤程序起始细胞液量可达到2000mL。
CellSep Pro软件操作系统简单易上手，配置Linux内核，相对较开放，用户可以根据自己的需求设置用户权限、工艺参数，且细胞数据完整、可追溯。
小结
只有深入了解制造过程中的关键需求以及每种技术的优缺点，才能选择出合适的自动化解决方案。一般来说，新一代的洗涤浓缩设备更受欢迎，因为它们占地更小，易于使用和软件支持。Sepax和Sefia等系统的处理参数类似于台式离心系统，因此其开发过程更加直观，适用于经验较少的团队；Lovo系统可以去除DMSO，并处理低密度的细胞，可能更适合儿科应用；Ekko系统适用于处理高声学对比度(如微载体)和高细胞密度(如单采单元)的原料；Rotea系统则在自动化编程方面具有很大的灵活性，体积控制比较精确且处理体积范围宽广比较适合希望根据自己的需求定制流程的用户。随着ATMP的制造过程中的工艺稳健性的要求提升，体积控制比较精确的Rotea系统开始被越来越多的用户引进。
未来在这一领域的发展可能会发展更灵活和定制的模块化设备组件，而不是开发新的设备。在这一方向下，如何连接不同设备将是一个挑战。未来的发展也将鼓励细胞治疗技术的开发者和设备技术行业伙伴之间的合作，在细胞制造领域提出创新的解决方案。
参考资料：
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