与CAR-T比美，CD3重导向双抗为免疫治疗带来新气象
2021年8月26日/医麦客新闻 eMedClub News/--双特异性抗体（BsAb）是近年来一种新兴的肿瘤治疗方法。传统单抗是通过两个Fab臂识别相同的抗原，与之不同，双抗则可以在两个抗原结合臂上分别识别不同的抗原。
在众多双抗中，CD3-BsAb （CD3重导向双抗）尤为特别，因为它可以使T细胞有效地识别并杀伤肿瘤细胞。目前在已有多个CD3-BsAb成功在临床中用于治疗血液肿瘤，同时也正积极地向实体瘤方向拓展。安进、罗氏、强生和再生元是目前在这一领域较为活跃的公司，临床管线中有多款CD3-BsAb的资产。
下图阐明了CD3-BsAb的作用机制：
CD3-BsAb发挥治疗作用，主要是通过同时结合肿瘤细胞上表达的肿瘤相关抗原（TAA）和T细胞上的CD3靶点。与CAR-T类似，CD3-BsAb将这两种细胞交联，形成免疫突触，导致T细胞被击化，并让T细胞在此过程中分泌出炎性细胞因子和细胞溶解分子，从而杀死肿瘤细胞。此外，CD3-BsAb的优势在于，无论TCR特异性为何， ”所有”T细胞亚群 (Pan T Cell Population) 都可被击化为“效应细胞” (Effector Immune Cells)。不过，这也是把双刃剑，因为这有可能造成过度的免疫刺激 (尤其是TH1 和 TH17 等T细胞亚群 )，从而导致细胞因子风暴。另外，这种泛T细胞亚群刺激还包括Treg细胞，未成熟的T细胞和 “已枯竭”的 T细胞，去牵扯它们也非好事。
近年来，科学界在双抗领域有了新的突破，从而发展出不同种类的新型CD3-BsAb。目前，已有100多种不同结构的CD3-BsAb被成功开发出来。众多的形式决定了抗体的诸多特性，例如半衰期、免疫原性、疗效反应类型、穿透实体瘤能力等等。值得注意的是，Fc臂的活跃度也能增加CD3-BsAb激活免疫细胞的能力。不过，活跃度过高，则会带来更强烈的炎症反应，随之可能产生更严重的毒副作用。
下图为这些不同形式CD3双抗结构的示例：
CD3-BsAb与CAR-T的比较
CD3-BsAb和CAR- T有许多相似之处：都以一个TAA表面抗原为靶点，都是利用T-Cell Effector的功能，都成功地在临床中应用于治疗恶性血液肿瘤，也都显示出相类似的毒副反应特征。不过CD3-BsAb 比CAR-T 有如下优点：
（1）患者需要在输注CAR-T细胞前进行“淋巴细胞清除” (Lympho-Depletion)，而CD3-BsAb则不需要；
（2）大部分CAR-T都必须为每位患者单独进行autologous 制备，而CD3-BsAb却可以作为“现货供应”的长期治疗药物，无需为个别患者单独制备；
（3）CAR-T大多是分成1-2次注射，剂量很难被调整；CD3-BsAb则为药物，剂量与给药频率都非常容易被调整，从而达到最佳疗效；
（4）血液肿瘤被清除后，CD9 靶向的CAR-T细胞仍能留在患者体内， 导致B细胞被持续消耗；而CD3-BsAb作为药物，会随时间推移从血液中被清除。
下图阐明了CD3-BsAb和CAR-T 的开发时程：
在血液肿瘤中的研究进展
安进的Blinatumomab（BiTE格式的CD19xCD3）于2014年获得FDA批准上市，是目前最成功的CD3-BsAb双抗。该药用于治疗复发或难治的急性淋巴细胞白血病（ALL）患者。与标准化疗相比，40%以上接受Blinatumomab治疗的患者能达到完全或部分缓解（CR/PR），中位总生存期能提高多几个月。除Blinatumomab外，目前还有许多其他CD3-BsAb正在进行临床试验，例如CD19、CD20、CD38、BCMA、CD33和CD123等等。
此外，在一个1/2期临床试验中，患有急性骨髓性白血病（AML）的患者使用MacroGenics公司的Flotetuzumab（CD123xCD3-BsAb）进行治疗，其总有效率（ORR）为30%。另一项Abbvie/Genmab公司的Epcoritamab（CD20xCD3-BsAb）的1/2期临床实验中，对弥漫性淋巴大B细胞瘤（DLBCL）患者显示出44%的完全缓解（CR）和11%的部分缓解（PR），而滤泡性淋巴瘤患者则有 100%的缓解（PR）。其他多个CD20xCD3双抗也获得了类似的优异结果，例如，在NSG小鼠中，再生元公司的REGN1979（CD20xCD3-BsAb）比罗氏的Rituximab (CD20单抗) 能更好地控制肿瘤生长，进一步证明了CD3-BsAb类药物的疗效。
细胞因子风暴
安进公司的Blinatumomab在临床试验中显示细胞因子风暴（CRS）为其最重要的毒副反应之一。CD19表达的肿瘤细胞，与大量健康的B细胞和T细胞处于同一环境时，会使CD3-BsAb介导的T细胞活化突发性地进行，从而过度释放炎性细胞因子，如IFN-γ、IL-6和TNF-α等，最终导致从发热到多重器官衰竭等症状。然而，CRS不是Blinatumomab独有的毒副作用。事实上，在大部分CD3-BsAb和CAR-T治疗中， CRS都经常出现。
下图阐明了细胞因子风暴的机理：
在人源化小鼠模型中表明，CD3-BsAb诱导CRS的主要介质物是被激活T细胞所产生的TNF-α，从而导致monocytes细胞大量分泌炎性细胞因子。研究发现，阻断上游TNF-α和其下游的IL-1β或IL-6都能够有效地缓解CRS。
另外，在小鼠和猴子模型中进行的几项临床前研究表明，通过降低CD3的亲和力（即使用“较弱”的CD3），也可降低细胞因子风暴的程度。目前在国外已有多家生物科技公司正在这个新方向上进行探索。
Fc臂沉默的重要性
尽管目前已知的CD3-BsAb大多是用于治疗血液肿瘤，但第一个获批上市的CD3-BsAb却是治疗实体瘤的Catumaxomab (EpCAMxCD3-BsAb)，由德国Fresenius Biotech和Trion Pharma两家公司合作研发。该药是一种用于治疗EpCAM阳性恶性腹水的CD3-BsAb，于2009年首次获得EMA批准上市。该药的Fc臂能够结合FcR表达细胞，从而诱导强烈的免疫反应；不过，Kupffer细胞同时也会被激化，因而造成严重的肝脏毒性。
由于销售不佳和其他商业原因，Catumaxomab 最终被制造商自愿于2013年从美国撤市和2017年从欧盟撤市。当然，其毒副反应也显示出CD3-BsAb中带有活性Fc臂的风险。正是由于这一教训，目前正在研发的所有CD3-BsAb都以Fc臂沉默为主。事实上，具有活性Fc臂的CD3-BsAb并不能将T细胞带向肿瘤，而是诱导T细胞在肺部中积聚和造成T细胞耗竭。Fc臂沉默的CD3-BsAb则不会导致T细胞在肺部中积聚，从而增加了流向肿瘤的机会。总的来说，带有沉默Fc臂的CD3-BsAb会有更好的疗效和更低的毒性。
在实体瘤治疗上的进展
虽然CD3-BsAb在血液肿瘤方面显示出巨大的潜力，然而，CD3-BsAb在实体瘤的治疗上依然面临着一些挑战，其中原因会在后面详述。目前，临床研究阶段中的许多靶点都集中在一些经典的TAA上，例如CEA、EGFR、EpCAM、HER2和PSMA等。不过，临床前研究阶段中的TAA靶点，则异彩纷呈，其中包括B7-H4、CD133、CD155、CLDN6、c-MET、EphA10、FOLR1、Intergrin β4（ITGB4）、P-cadherin、PRLR、ROR1、TRAIL-R2、TfR和Trop-2等。相信这些新靶点在未来将会呈现出精彩数据，大家不妨拭目以待。
目前，这些CD3-BsAb的应答率中，PR最高约为15%， SD则为40-50%。安进公司有一款PSMA靶点的CD3-BsAb，在两名病人中获得了长期疗效，患者在骨骼和软组织上的癌细胞转移都明显地消退，因而总生存期 (OS) 大大提高。总的来说，目前这些临床数据所呈现出的利好消息，表明未来CD3-BsAb在实体瘤的治疗上将大有可为。不过，安全性的提升空间依然很大， 除了细胞因子风暴，其它毒副作用，如肝功能异常、结肠炎、腹泻、低血压、缺氧等等也时有出现。不过，这些毒副作用大多是肿瘤内的炎症所引起，一般都只是暂时性反应，在治疗停止后大多都能迅速恢复正常。
CD3-BsAb在实体瘤中所面临的挑战
对于CD3-BsAb在血液肿瘤中比在实体肿瘤中疗效更佳的观察，其实源于实体肿瘤所特有的本质。在众多挑战里面，以下为重中之重的几点：
1.对健康组织所产生的毒性——在血液肿瘤中，B细胞或髓样细胞的暂时缺失都是可逆的。只要干细胞不受影响，它们就能迅速地补充血液中的正常细胞。对比而言，实体瘤TAA大多在正常组织中也有表达。因此，如何谨慎选择肿瘤特异性TAA是非常重要的。
2.T细胞进入肿瘤的屏障——对于血液肿瘤而言，血液中的癌细胞很容易就被T细胞所包围，这使CD3-BsAb能够无休止的从效应免疫细胞池中提取并激活T细胞以对抗癌细胞。相反，实体瘤需要T细胞浸润到肿瘤内部，才能达到治疗效果。如何增加效应免疫细胞穿透肿瘤间质的屏障，是CD3-BsAb治疗实体瘤成功的重要因素。
3.肿瘤微环境 (TME)——TME中的免疫抑制细胞，包括肿瘤相关成纤维细胞（CAF）、髓源性抑制细胞（MDSC）和调节性T细胞（Treg），都会产生TGF-β、IL-10、IDO等因子，这些因子能阻碍T细胞的代谢和活化。如何减少TME中的这些抑制因素，亦是CD3-BsAb是否成功的主要关键。
解决挑战的策略
1.CD3-BsAb双抗的安全性
寻找最佳TAA是非常困难而复杂的。最理想的靶点，当然是应该只在肿瘤细胞上表达，而在健康细胞中没有。然而，这样绝对理想的TAA似乎并不存在。所以，一个在药物研发方面更加务实的思路，是应该去寻找那些在肿瘤上高表达，但在健康细胞中相对较少表达的TAA。靶向这些TAA，可以使我们在肿瘤与健康细胞间，根据靶点表达程度的不同, 而获得最高的选择性。
为了提高肿瘤的选择性和减少靶向健康细胞，还可以通过设计2:1的CD3-BsAb来提高TAA的亲和力。这些2:1比例的 CD3-BsAb包含第二个TAA结合片段，产生如CD3 x TAA x TAA的双抗。一些临床前研究表明，在体外试验中使用一款 “2:1 HER2靶向CD3-BsAb” 时，抗体的特异性明显增强，能够更为有效的延缓NSG小鼠中HER2高表达肿瘤的生长。在另一项临床前研究中，科研人员观察到“2:1 CEA靶向CD3-BsAb”的选择性也有类似的提高。这款CD3-BsAb在治疗晚期CEA阳性肿瘤患者时，显示出不错的肿瘤抑制作用（PR 5%，SD 11%），且毒副反应可控。
增加特异性的另一条途径，是为CD3-BsAb设计一个可以在肿瘤微环境（TME）中被激活的前药 (ProDrug)。实体瘤与正常健康组织有许多生理特征上的差异：如缺氧导致的低pH值、ECM的过度产生、以及因配合肿瘤野蛮生长所产生的众多蛋白酶而造成的蛋白质水解增加等。如果能按照这些差异性，在CD3-BsAb的结合区域上设计一个能够被蛋白酶所清除的屏蔽物，就能够减少对健康组织的伤害。在TME中的众多蛋白酶能确保拥有屏蔽物前药的CD3-BSAb双抗的结合区域，在到达肿瘤后能够被蛋白酶迅速切割而把屏蔽物移除，从而恢复双抗活性。
屏蔽物前药技术目前已被多家欧美公司验证，下图为罗氏公司靶向 FOLR1xCD3的TCB前药技术：
2.T细胞进入肿瘤的屏障
根据 T细胞在肿瘤中的浸润程度，可以将肿瘤分为以下三类：炎性肿瘤型、免疫排斥型、和免疫沙漠型。炎性肿瘤型就是一般大家所熟悉的“热肿瘤“， 这类肿瘤对IO药物或CD3-BsAb 效果都非常好，这里不再讨论。免疫排斥或免疫沙漠型肿瘤通常含有极少或根本不含T细胞，因此会影响CD3-BsAb的治疗效果。有趣的是，瘤内注射溶瘤病毒可以诱导抗病毒免疫反应， 从而激活T细胞向这类免疫沙漠型肿瘤（例如B16F10黑色素瘤、KPC胰腺癌）的流动，这使随后CD3-BsAb治疗的疗效大大增强。这些数据确认了炎性TME微环境对CD3-BsAb疗效的重要性。
3.充满免疫抑制性分子的TME
在进入肿瘤之后，T细胞还会面临另一挑战：一个不友善的免疫抑制性肿瘤微环境。免疫检查点配体（如PD-L1、HLA-E等）在许多癌症的TME中都常有表达。因此，一些临床研究也积极地探索CD3-BsAb和IO药物的联合疗法，例如，罗氏公司就曾探索CEAxCD3-BsAb与Atezolizumab（PD-L1单抗）联合用药在治疗晚期CEA阳性肿瘤患者的效果。与CD3-BsAb单药相比，联合疗法显示出更好的抗肿瘤效果，并且毒副作用并未增加。从这个例子中看到，CD3-BsAb与IO联合用药在未来将是一个很好的治疗方案。
然而，免疫检查点配体并不是抑制T细胞功能的唯一因素，肿瘤细胞也能产生低氧和低葡萄糖的TME。在这些缺氧条件下，缺氧诱导因子（HIF）启动CD39、CD73、腺苷等的表达，从而抑制了T细胞的效应功能。此外，低葡萄糖环境也会抑制T细胞的活力和存活。除了这些肿瘤介导的因子外，基质细胞、浸润性Treg和MDSC细胞还能分泌其他免疫抑制因子，如TGF-β、IL-10、IDO和Arginase等。例如，TGF-β能够抑制T-Cell Effector功能，并抑制CD4+细胞的分化，却又能同时促进Treg细胞的增加。IL-10则可通过减少对抗原呈递细胞（APC）的共刺激，从而导致T细胞丧失能力，并阻止新效应T细胞的发育。
抑制MDSC也是一个热门方向，目前有多项研究正在针对如何消除它们，或防止它们迁移到TME内，从而提高抗肿瘤活性。虽然目前尚无在实体瘤中研究CD3-BsAb和针对MDSC的联合用药，但一些血液肿瘤的研究结果显示，CD33xCD3 BsAbs能够同时介导对AML和MDSC细胞的杀伤，因而疗效不错。抑制Treg细胞也是另一个热门研究方向， 因为它们能分泌众多免疫抑制细胞因子，如IL-4、IL-10和TGF-β等。在一项EGFRxCD3-BsAb与抗CTLA-4抗体（能减少Treg细胞）的联合用药试验上，发现不单T细胞增殖培增，T细胞的杀伤力也同时增强。到目前为止，将CD3-BsAb与MDSC 或Treg消除疗法相结合，已产生出积极的临床前数据，这为进一步沿此方向进行探索提供了重要参考。
下图展示在肿瘤微环境内，对T细胞的众多不利条件：
优诺健公司的研发方向
优诺健（UnogenBio）对CD3-BsAb双抗一直深感兴趣，基于上述的众多挑战，优诺健都能以不同科技一一克服。首先，我们会谨慎而仔细地选择TAA 靶点，以确保它们都会在肿瘤中更高表达，而在健康的正常组织较少表达。同时，我们亦采用全球顶尖的蛋白质工程对药物进行设计与改造，以避免Fc活性，从而避免类似Catumaxomab所引起的安全问题。公司也将采用2:1甚至更高比例的TAA以及屏蔽CD3的前药技术，从而增加特异性并降低正常组织中的毒性。我们也正在探索如何在药物中增加IO组件，从而增加T细胞浸润并减少免疫检查点抑制所造成的干扰。对于免疫沙漠等冷肿瘤，我们还将积极地与溶瘤病毒伙伴公司合作，以探讨在临床研究时采用联合治疗方案。
公司亦不会只满足于目前已拥有的相关技术，面向未来，优诺健已经开始了第二代资产的紧密布局。目前，为了在最大程度上提升我们在肿瘤治疗方面的科技水平，我们已开始探索特异性更强的T细胞亚群（例如CD8+ Cytotoxic T 细胞 或 CD8+ Tissue-Resident Memory T 细胞），以及能够抑制TME中的MDSC和Treg的其它新药。相信优诺健今天所播下的种子，在不久的将来能结出累累的硕果。
小结
作为一种近年来比较火热的免疫治疗方法，CD3-BsAb的前途不可限量。基于科学家不断在研究上投入的巨大努力，全球每年都有更多的肿瘤特异性TAA可以被CD3-BsAb所采用。随着科技水平的不断攀升，细胞因子风暴和其它毒副反应在未来也必更加易于被控制。
基于优诺健所储备的科技力量，我们将继续在CD3-BsAb的创新上奋发 ，努力去满足大量肿瘤患者未被满足的治疗需求。未来可期！
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