Nature Reviews | 用于传染病的mRNA疫苗：原理、递送和临床转化

三十多年前，mRNA核酸疫苗的设想就已经诞生。2020年新冠疫情的大流行促成了历史上最快速的疫苗开发，也让mRNA疫苗走到了聚光灯下，人们开始期望希望能生产出安全、多功能、易于生产的mRNA疫苗，应用到更多疾病领域。

近日，Nature Reviews | Drug Discovery上发表了一篇名为“mRNA vaccines for infectious diseases: principles, delivery and clinical translation”的综述，简述了mRNA疫苗在传染病领域的技术基础、递送系统和临床转化，展示了mRNA疫苗的应用现状。

mRNA设计与合成的原理

体外转录（IVT）的mRNA可模拟内源性mRNA的结构，包括五个部分：5’端帽，5’端UTR，一个编码抗原的开放阅读框，3ʹ端UTR和3’末端polyA尾。

体外转录的mRNA结构示意图

自扩增的IVT mRNA还可包括病毒来源的复制酶基因，能编码RNA依赖的RNA聚合酶，从而增强mRNA在细胞内转录，使mRNA在低剂量也可大量表达抗原。

5’端帽结构与天然真核mRNA相同，可以阻止病毒RNA细胞质传感器的识别，此外，还可以保护mRNA不被外切酶降解，并与3’末端的polyA尾、polyA结合蛋白和翻译起始因子蛋白协同工作，使mRNA环状化并募集核糖体以启动翻译。

PolyA尾的长度间接调节mRNA的翻译和半衰期，polyA尾结合蛋白形成复合物是启动mRNA翻译的必要条件。编码区两侧的5'和3'UTR调控mRNA的翻译、半衰期和亚细胞定位。

mRNA疫苗的开放阅读框是最关键的组成部分，因为它包含翻译成蛋白质的编码序列，可以在不改变蛋白质序列的情况下，通过将很少使用的密码子替换为编码相同氨基酸残基的、更经常使用的密码子来优化mRNA翻译。

为了最大化mRNA的翻译，mRNA序列通常包含修饰的核苷，例如假尿苷、N1-甲基假尿苷或其他核苷类似物。修饰核苷，特别是修饰尿苷，阻止了模式识别受体的识别，保证了翻译过程可以产生足够的蛋白质。

除了对mRNA序列的改进，在简化mRNA生产方面也取得了重大进展。例如，临床上使用的合成mRNA是从DNA质粒中利用噬菌体RNA聚合酶T7(也可以使用T3和SP6聚合酶)体外转录而得的，可去除双链RNA(dsRNA)污染物、反应物和不完整的转录本。其他方法包括使用来自牛痘病毒的capping和2'-O-甲基转移酶进行反应等，简化了纯化步骤。

mRNA的递送载体

由于mRNA质量较大（10⁴-10⁶Da），并带有负电荷，因此不能通过细胞膜的阴离子脂质双分子层。此外，在体内，它会被固有免疫系统的细胞吞噬，并被核酸酶降解。在培养皿中进行细胞内mRNA递送的方法有电穿孔、基因枪和体外转染等，但体内递送mRNA则需要使用能够在转染免疫细胞的同时不引起额外免疫毒性的递送载体。

脂质纳米颗粒（Lipid-based nanoparticles，LNPs）

脂质纳米颗粒是目前最多临床应用的mRNA递送载体。截止2021年6月，所有正在开发或批准临床使用的SARS-CoV-2 mRNA疫苗均采用脂质纳米颗粒。LNPs作为mRNA递送载体有许多优点，包括易于配方、可模块化、生物相容性和较大的mRNA有效载荷能力等。

除了RNA药物之外，LNPs通常还包括四种成分：一种可电离的脂质，胆固醇，一种辅助磷脂和聚乙二醇化脂质，它们一起包裹和保护脆弱的mRNA核心。

LNPs结构示意图

阳离子脂类DOTMA及其合成类似物DOTAP是1989年第一个传递mRNA的脂类。它们的带正电荷的胺有利于包裹带负电荷的RNA。但是这种脂类会引发促凋亡和促炎症反应毒性。

聚合物纳米颗粒结构示意图

为克服这种安全问题，研究人员开发了可离子化脂类（如DODAP和DODMA）。这些脂质在生理pH值下被注入血流时是中性的，安全性优于阳离子脂质，并延长了药物循环时间。可离子化脂质与mRNA在酸性缓冲液中形成纳米颗粒，使脂质带正电并吸引RNA。此外，它们在内涵体的酸性环境中带正电，这促进了它们与内涵体膜的融合，使它们能被释放到细胞质中。

除可离子化脂质外，其他三种脂质成分也促进了纳米颗粒的形成和功能。胆固醇通过填充脂质之间的空隙来增强纳米颗粒的稳定性，并且在内吞的过程中帮助与内体膜融合。辅助性脂质通过促进脂质相变来调节纳米颗粒流动性并增强效率，同时也影响靶器官的特异性。

聚乙二醇化脂质组分则由聚乙二醇(PEG)与锚定脂质如DMPE或DMG结合而成。亲水PEG稳定LNP，通过限制脂质融合来调节纳米颗粒的大小，通过减少与巨噬细胞的非特异性相互作用来增加纳米颗粒的半衰期。针对新冠肺炎的mRNA-1273和BNT162b2疫苗均含有聚乙二醇化脂质。

共聚物和聚合物纳米颗粒

尽管不及LNPs的临床案列，聚合物拥有和脂质体相似的mRNA递送效率和优势。阳离子聚合物可将核酸浓缩形成各种形状和大小的多聚物，并通过内吞作用将其递送到细胞中。

聚乙烯亚胺是研究最广泛的核酸递送聚合物，虽然功效极佳，但由于电荷密度高导致的毒性限制了它的应用。通过应用低分子形式，加入PEG，链接环糊精或二硫键等方法可以有效减低PEI的毒性。

聚合物纳米颗粒结构示意图

此外，研究人员还开发了几种毒性较小的生物可降解聚合物，例如聚β-氨基酯、聚氨基胺、聚天冬酰胺等。例如，带有乙二胺侧链的聚乙二醇化的聚(天冬酰胺)可将mRNA递送至肝脏，大脑，脊髓，膝关节和嗅觉神经。

其他

除上述两种载体外，多肽也可以将mRNA递送到细胞中，其主链和侧链中的阳离子或两亲胺基团(例如精氨酸)，可以通过静电结合mRNA并形成纳米复合物。例如细胞穿透肽产品PepFect14，可在异种移植小鼠模型中将mRNA传递给卵巢癌细胞。与mRNA结合的鱼精蛋白可以激活Toll样受体(TLR7、TLR8)通路，识别单链mRNA，CureVac就正在评估一种含有鱼精蛋白的递送平台RNActive，用于黑色素瘤、前列腺癌和非小细胞肺癌的临床试验。

以角鲨烯为基础的阳离子纳米乳也能递送mRNA。一些角鲨烯配方，如诺华的MF59，在FDA批准的流感疫苗中作为佐剂。

mRNA疫苗治疗传染性疾病的研究进展

mRNA疫苗治疗传染病的不同策略

新型冠状病毒

大多数SARS-CoV-2候选疫苗的原理是诱导对病毒表面刺突蛋白的免疫反应。刺突蛋白与宿主细胞表面的受体血管紧张素转换酶2结合后，附着的刺突蛋白被细胞的跨膜丝氨酸蛋白酶2切割开，诱导构象变化，暴露刺突蛋白的融合肽，促进其与细胞或内体膜的融合。

截至2021年6月18日，已有185种COVID-19候选疫苗处于临床前开发阶段，另有102种疫苗进入临床试验，其中19种是mRNA疫苗。

2020年12月11日，辉瑞/BioNTech的疫苗BNT162b2获得了FDA紧急授权，成为首个获批的mRNA药物。一周后，Moderna的mRNA-1273也获准在美国使用。辉瑞和BioNTech共同开发了5种编码突刺蛋白抗原变体的mRNA疫苗候选产品。其主打产品为BNT162b1和BNT162b2，其中所有尿苷都被N1-甲基伪尿苷取代，以增强mRNA翻译。BNT162b1编码刺突蛋白受体结合域的三聚体分泌型，而BNT162b2编码全长SARS-CoV-2刺突糖蛋白，在S2亚基上有两个脯氨酸替换，这将蛋白锁定在其融合前构象。

在国内，复星医药“复必泰”的审批也已进入行政审批阶段。此外还有沃森生物/艾博生物研发的ARCoV、斯微生物的mRNA疫苗和艾美疫苗/丽凡达生物的候选产品进入了临床阶段。

流感

流感病毒变异体较多，且传统流感疫苗是在鸡蛋中培养的灭活流感病毒，生产时间长，纯化困难。因此，确实需要替代抗原靶点和生产方法。体外转录的合成mrna可以满足这一需求，并确保在出现全新流感毒株时快速生产疫苗。

2013年，一种基于LNP的自扩增mRNA疫苗在中国H7N9爆发后8天内迅速研制成功，但由于没有GMP生产的条件，未进入1期临床阶段。目前研究人员还在努力研制一种不需要每年修改的通用流感疫苗，可提供对几种流感毒株(异源免疫)和亚型(异亚型免疫)的免疫。几种载体(DLinDMA、DOTAP、聚亚胺和阳离子纳米乳剂)、替代mRNA技术(核苷修饰mRNA和自扩增mRNA)和替代抗原靶点均已被用于mRNA流感疫苗。

不易发生突变的血凝素柄区最近已成为新的通用疫苗靶点。2021年6月22日，赛诺菲的疫苗全球业务部门赛诺菲巴斯德和Translate Bio合作启动了一项评估mRNA疫苗治疗季节性流感的1期临床试验。两家公司将在该1期临床试验中中评估两种疫苗配方（MRT5400和MRT5401）。

寨卡病毒和登革热

所有的寨卡病毒感染都是由单一的血清型引起的，这表明接种任何一种病毒的抗原都可以预防所有的寨卡病毒。

膜和包膜蛋白(prM-E)是抗寨卡病毒mRNA疫苗常见的抗原选择，抗prM-E的中和抗体可以防止病毒融合。一项研究显示，单剂30µg或50µgLNP核苷修饰的prM-E mRNA疫苗产生的中和抗体滴度比纯化灭活病毒和DNA疫苗在小鼠体内产生的中和抗体滴度高50-100倍，比1mgDNA疫苗在猕猴体内产生的中和抗体滴度高50倍。

登革病毒与寨卡病毒来自同一病毒家族，它们的包膜蛋白有54-59%的氨基酸序列重叠。因此，寨卡疫苗编码的包膜蛋白抗原可能刺激抗体的产生，这些抗体与登革热包膜蛋白发生交叉反应。

一项1期试验的中期结果表明，Moderna的mRNA-1893疫苗在10μg和30μg剂量组可诱导94-100%的血清转化，并且耐受性良好。另一项研究采用被动免疫方法，使用基于角鲨烯的纳米载体传递中和ZIKV-117单克隆抗体(mAbs)的mRNA，表明mRNA编码的中和单克隆抗体可能具有预防和治疗活性。

HIV

在全球范围内，艾滋病毒目前影响着3800万人，预计到2030年将影响多达4200万人，但目前仍然没有开发出有效的疫苗。这主要是由于HIV包膜蛋白具有显著的抗原多样性和密集的“聚糖屏蔽”（glycan shield）能力，能隐藏关键的包膜蛋白抗原表位。

目前已有一些临床前研究使用多种载体递送编码HIV蛋白的mRNA疫苗，包括阳离子纳米乳剂、DOTAP/DOPE脂质体、聚合物和可离子化LNPs。这些研究表明，除了有效的载体外，必须开发新抗原以有效地靶向HIV。

一种新的艾滋病毒疫苗接种策略是从能中和几种艾滋病毒毒株的感染者体内分离广谱中和单克隆抗体。近期，广谱中和单克隆抗体VRC01最近受到了关注，因为它们能够中和98%的HIV毒株，防止抗体敏感毒株传播的有效性达到75.4%。在一项研究中，其mRNA产品经LNP封装、核苷修饰以表达VRC01，静脉注射剂量为单次0.7mg/kg，最终产生的抗体浓度与注射一剂10-20mg/kg的mAb蛋白通常产生的抗体浓度相似，可以保护小鼠免受静脉注射HIV-1的影响。

呼吸道合胞体病毒（Respiratory syncytial virus ，RSV）

呼吸道合胞病毒是全球急性下呼吸道感染的主要原因，每年造成约60000名5岁以下儿童、14000多名65岁以上老年人死亡。

1968年，一种福尔马林灭活的RSV候选疫苗引起了儿童的疫苗相关增强疾病（VAED）。VAED会使肺部嗜酸性粒细胞和中性粒细胞过度浸润，导致80%的接种儿童发生严重毛细支气管炎或肺炎，造成2例死亡。

目前的RSV候选疫苗主要针对有助于病毒融合且高度保守的F蛋白。尽管一些候选疫苗由于中和抗体滴度不足，临床试验宣告失败，但对F蛋白构象的新发现揭示了针对预融合构象的疫苗能诱导出更好的中和抗体反应。这一发现有望改善未来的疫苗设计。

mRNA疫苗可以通过工程编码序列来编码稳定的F蛋白构象。在多个临床前研究中，编码天然RSV F蛋白或稳定预融合构象的mRNA疫苗均可以使用阳离子纳米乳剂和LNPs作为载体成功递送，没有观察到任何VAED实例。

Moderna正在评估三种编码预融合F蛋白的单剂量候选疫苗：用于成人的mRNA-1172（使用默克公司专有LNPs）、mrna-1777（使用Moderna专有LNPs），以及用于儿童的mRNA-1345（使用Moderna专有LNPs）。

在1期临床试验中，mRNA-1777与RSV中和抗体引发了强大的体液反应，CD4+ T细胞对RSV F肽产生了反应，且没有严重的不良事件。1期中期数据表明，100μg剂量的mRNA-1345在接种1个月后产生的中和抗体滴度大约是mRNA-1777的8倍。Moderna的目标是将mRNA-1345与其儿科人偏肺病毒/副流感病毒3型（hMPV/PIV3）候选疫苗产品mRNA-1653整合在一起，并作为一种单独配方为儿童接种针对三种不同病原体的疫苗。

埃博拉病毒（EBOV）

2014-2016年西非爆发的埃博拉疫情夺走了11000多条生命。2019年，FDA批准了一种基于重组水疱性口炎病毒(VSV)的埃博拉疫苗(rVSV-EBOV)。尽管与没有接种疫苗相比，rVSV- EBOV在预防埃博拉传播方面的有效性为97.5%，但临床试验中显示出一些安全性问题。

针对EBOV的mRNA疫苗可能比这种基于病毒的疫苗更安全，因为它们不会在体内复制。一种mRNA疫苗已在小鼠中证明了其有效性，该疫苗将未经修饰的、自扩增的编码EBOV糖蛋白的mRNA传递到聚(氨基胺)树状聚合物纳米颗粒中。该疫苗可诱导CD8+和CD4+ T细胞产生糖蛋白特异性IgG抗体，并产生高表达的IFNγ和IL-2，两种剂量方案(两剂4μg或一剂40μg)均可保护小鼠免受死亡。另一项研究使用LNP封装、核苷修饰的编码EBOV糖蛋白的mRNA，以两次20μg的剂量接种至豚鼠，诱导产生高抗体滴度，保护动物免受病毒的致命攻击。

狂犬病毒

尽管狂犬病疫苗已获批准，但每年仍有超过5万人死于狂犬病。为了满足这一需求，CureVac已经部署了其RNActive平台，在其狂犬病候选基因CV7201中递送编码狂犬病毒糖蛋白的未经修饰的mRNA。

在小鼠和猪的模型中，需间隔21天接种两剂80µg的疫苗，可诱导高中和抗体滴度，并引起抗原特异性CD4+和CD8+ T细胞应答。其1期试验终期测试了不同给药途径(真皮内或肌肉内)和不同给药装置(标准注射器或无针皮内注射器)的效果。有趣的是，尽管给药途径不影响免疫反应，但给药装置却影响了免疫反应，只有皮内注射器产生了短暂的体液反应。给药效力弱，加之不良事件发生率高，这表明CureVac需要进一步优化给药平台。

随后，CureVac使用由Acuitas Therapeutics公司生产的专有LNPs作为其新型狂犬病候选药物CV7202的递送载体。在一项临床前研究中，CV7202递送未经修饰的编码狂犬病病毒糖蛋白的mRNA，并产生强大的抗体和CD8+和CD4+ T细胞应答。在非人类灵长类动物中，受试动物间隔28天注射两次100µg剂量狂犬病疫苗，结果显示具有良好的耐受性，其抗体滴度比商业许可的狂犬病疫苗高20倍。其1期研究结果表明，两剂1µg剂量的疫苗就能产生较高的中和滴度和较强的适应性免疫反应，且耐受性良好。

疟疾

疟疾是由疟原虫属的单细胞真核寄生虫引起的，其发病率和致死率位居榜首。目前，人体对疟原虫感染的自然免疫反应已经确定了潜在的非表面抗原靶点。例如，疟原虫分泌的巨噬细胞迁移抑制因子(PMIF)已经被证明可以阻止T细胞形成长期记忆。

在这一发现之后，研究人员用角鲨烯为基础的阳离子纳米乳剂作为载体，来递送编码PMIF的自扩增mRNA，研制出了疫苗。两种15µg引物增强剂可改善辅助T细胞的发育，并诱导抗疟疾IgG抗体和记忆T细胞反应。此外，从接种过疫苗的小鼠身上过继转移T细胞可以保护未接种过疫苗的小鼠免受疟原虫孢子体的伤害。

mRNA疫苗目前面对的挑战

原则上，mRNA疫苗比传统疫苗有几个优势。

• mRNA不整合到基因组中，从而避免了插入突变的问题

• mRNA疫苗可以以无细胞的方式生产，允许快速、可扩展和成本效益高的生产。例如，一个5升的生物反应器可以在一次反应中产生近100万剂mRNA疫苗。

• 一种单一的mRNA疫苗可以编码多种抗原，增强针对适应性病原体的免疫反应，并能以单一配方靶向多种微生物或病毒变体。

但在此基础之上，mRNA疫苗的应用依然需要面对更多挑战。

抗体持续应答时间

为加强抗体的持续应答时间，一些转运系统选择以抗原提呈细胞为目标来翻译mRNA，例如将单克隆抗体与LNPs表面结合、使用树突状细胞特异性配体来修饰LNP表面，调整癌症疫苗LNPs的表面电荷，等等。

mRNA疫苗通过转染抗原提呈细胞引起免疫

此外，另一种增强抗体应答时间的方法是通过延长抗原性mRNA的翻译来改变疫苗的药代动力学。一项小鼠研究表明，与携带未修饰mRNA的LNPs相比，包裹核苷修饰mRNA的LNPs循环时间更长，诱导的TFH细胞和生发中心B细胞反应更强。

不断出现的病毒变体

就新冠疫情而言，新冠病毒的多次变异已经引起了人们对mRNA疫苗的交叉变异效力的关注。幸运的是，FDA批准的mRNA疫苗BNT162b2和mRNA-1273能产生针对B.1.351和P.1以及其他变体的交叉中和抗体，这表明它们可以对这些变体提供保护。

目前已经证明，编码新冠病毒刺突蛋白的核苷修饰mRNA-LNP疫苗可以诱发SARS-CoV-1和batCoV的交叉中和抗体。与艾滋病毒和流感一样，新的结构观点有望促进研究者发现冠状病毒的保守位点，加速抗原发现和疫苗设计。

安全性

mRNA疫苗已被证实具有良好的安全性，在临床试验中仅发生轻微或中度不良事件。然而，也有一些零散的事件说明，mRNA抗原和传递载体成分需要进一步优化。例如，CureVac基于鱼精蛋白的狂犬病候选药物CV7201在78%的参与者中引发了严重的不良事件，促使CureVac采用LNPs作为其后续狂犬病候选药物CV7202的首选交付平台。

在BNT162b2接种中，大约每百万分之4.7接种者出现过敏反应，而mRNA-1273的接种中，大约每百万分之2.5出现过敏反应，这大约是使用传统疫苗时的两到四倍。其原因可能是接种者在日常生活中对PEG已产生了抗体，据报道，40%的人群中存在抗PEG抗体，这可能会增加某些个体发生过敏反应的风险，并阻碍疫苗的有效性。在这一领域，研究人员日后可在疫苗配方设计时进行更多的考虑。

特定人群的疫苗接种

孕产妇、儿童、老年人等特定人群由于其免疫系统的不同，一些病毒对其会产生更严重的影响，而mRNA疫苗在该类人群中的使用也需要进一步的纵向评估。

不过目前的试验证明，针对新冠病毒的mRNA疫苗在孕妇和哺乳期人群中也被证明具有免疫原性，在脐带血和人乳中也检测到中和抗体，并且其不良事件比例与非孕人群类似，没有增加新生儿死亡或先天性异常的发生率。

越来越多的证据表明，mRNA疫苗可能对所有年龄组都有效。BNT162b2疫苗在所有年龄为125岁的治疗组中获得了93%的疗效，mRNA-1273在≥65岁的志愿者中有效率为86.4%，而在18-65岁的志愿者中有效率为95.6%。同时，mRNA递送载体可以作为炎症佐剂，通过增强抗原提呈细胞在注射部位的招募，来增强疫苗的免疫应答，提高老年人疫苗注射的疗效。

可及性

mRNA疫苗的运输需要冷藏，这影响了疫苗在一些国家或地区的可及性。日后的改进方向可能为耐高温疫苗的研究。如CureVac在临床前研究中证明，其序列优化的RABV-G狂犬病疫苗可耐受在−80°C至+70°C的温度暴露数月。

小结

mRNA疫苗在传染病领域的应用尚浅，但也已经展开了数十个临床试验。相信在行业不断发展的今天，针对各类传染性疾病的mRNA疫苗产品也将扩大涉足领域，不断探索更合适的设计、修饰与递送方式，mRNA疫苗的制造技术和生产工艺也将继续推陈出新。

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参考文献：

1.https://www.nature.com/articles/s41573-021-00283-5