就在春节前几天，Nature Genetics上背靠背发表了小麦抗叶枯病基因Stb6和无毒基因AvrStb6的克隆。题目分别为 “Wheat receptor-kinase-like protein Stb6 controls gene-for-gene resistance to fungal pathogen Zymoseptoria tritici”和“Stress and sexual reproduction affect the dynamics of the wheat pathogen effector AvrStb6 and strobilurin resistance”
我们的小编之一Rui Wang博士期间也是研究相似的病害，年前他对Stb6和相关的一些文献做了一个简单的介绍和梳理（七篇高质文章带你走进腐生病原菌抗病和育种的方方面面）。今天我们特邀美国北达科他州立大学的史公军老师为我们详细的导读一下Stb6这篇文章，希望对进行小麦基因克隆和抗病研究的同学有帮助。
很欣喜看到又一篇小麦的研究论文发表在Nature Genetics，因为我们目前也是研究腐生菌与小麦的互作方面，就文章中图位克隆部分做简单分析，与大家一起商榷。
小麦叶枯病(Septoria tritici blotch, Stb)是由小麦壳针孢叶枯病菌( Zymoseptoria tritici)引起，不同年份会造成5-10%的产量损失。Stb基因与其病原菌Avr基因的识别遵从Flor提出的“基因对基因”假说，而且它们的识别不会产生超敏反应，不同于其它报道的植物－专化型腐生菌互作模式，如小麦－ Parastagnospora nodorum遵从“反向基因对基因”假说，都是该系统的特别之处。目前虽然已有21个Stb抗性基因的报道，Stb6是第一个被克隆的抗叶枯病基因。
Around 70 percent of the fungicides used on wheat in Europe are aimed at controlling the fungal pathogen that causes Septoria leaf blotch, which can cut yields by up to 50 percent in humid and temperate areas. （https://eurekalert.org/multimedia/pub/162700.php）
作者首先利用中国春3AS的不同缺体定位，将Stb6定位于缺体区间3AS 0.45-1.00．利用GrainGenes 数据库中的SSR 标记，对96个 单株的CS/Ct DH群体及40个单株的Av/Cad DH群体进行低密度图谱的构建，从而将Stb6 定位于两个SSR 标记gwm369与gpw2132之间约8.1 cM区域。
接着利用包含1962个单株CS/Ct的F2群体进行精细定位。为了开发更多的遗传标记，作者对小麦Stb6基因区域与B. distachyon进行了共线性分析。通过与另外两张小麦的遗传图谱Apache × Balance 及 ITMI 图谱上的共同标记，将Stb6定位于两个SNP标记 SyOpL2500 、 SyOpL304（从文中并未看出作者如何界定该近端标记）之间。利用这两个SNP标记的开发序列去blastn B. distachyon的基因组序列，发现B. distachyon２号染色体上包含96个预测基因的769kb的区间 (Bd2g02010.1－Bd2g02900.1)与小麦 Stb6基因区间有很好的共线性。利用这96个候选基因去blastn小麦的基因组序列，获得的小麦同源序列用于设计SSR引物，开发了35对新的标记，其中的两对标记cfa3006 和cfa3010 在本研究的亲本间具有多态性，并定位到Stb6基因区域。（选择作图群体的亲本亲缘关系越近，重组子会越多，对于图位克隆是好事；但却不容易获得多态性的标记，所以选择作图亲本的时候，需要平衡遗传重组与序列多态性，或构建多个作图群体）。
利用共线性区间中部的19个RLK基因（Bd2g02426.1-Bd2g0253 7.1）反向Blastn IWGSC-CS survey sequence assembly v1，在小麦基因组序列中鉴定出了11个含有这些RLK基因的3A染色体特异的Contig。随后将这些基因在其它品种Courtot, Avalon，Cadenza中测序，以便进行SNP 标记开发，最终定位了5个遗传标记。利用其它的小麦基因组信息，鉴定出了Stb6基因区域的一个InDel标记，并将其转化为共显性PCR 标记ctg8311。最终这些遗传标记将Stb6 缩小为0.56cM 区间 (cfn80025-80030），其中两个标记ctg8311, cfn80023与Stb6共分离。
随后通过筛选BAC文库，将遗传标记与基因的物理图谱相结合。利用共分离的两个标记ctg8311, cfn80023及最近的侧翼标记cfn80025筛选中国春的BAC文库，获得９个阳性克隆，最大的克隆Tae-B-CsE-673A07通过PacBio技术进行测序、序列组装及注释。利用预测的基因对小麦全基因组序列TGACv1进行Blastn, 获得一个跨叠序列与Tae-B-CsE-673A07有64kb的重叠区域，且含有Stb6另一端标记cfn80030 and cfn80040。合并这两组序列共获得跨Stb6的155,870bp序列，其中包括了6个WAK基因及一个RLP基因。随着IWGSC WGA v1.0小麦基因组序列的公布，侧翼标记cfn80025 和cfa3010间大约400 kb的序列界定了Stb6的所在区域，新开发的SSR cfa3036 及cfa3037标记排除TaWAK1,2 为Stb6的可能性，这就剩余两个候选基因TaWAK3,4 。
作者通过五个方面对这两个候选基因进行了功能验证。
一是通过基因的表达分析，检测不同时间点及接种与否对基因表达的影响。TaWAK3在各种情况下都只有极微量表达，TaWAK4在接种病原菌后却有两倍的上调表达。二是对抗病、感病品种间基因外显子序列的多态性进行分析。TaWAK3外显子序列在抗病及感病品种间没有差异，而TaWAK4 却在两者间有一个错义突变。三是通过VIGS下调基因表达看其表型变化。下调TaWAK4表达水平明显降低了抗性品种CS 和Cad 的抗性水平，而下调表达TaWAK3并未发现其抗性变化。
四是对Cad EMS突变体的分析发现，10个TaWAK3无义或错义突变的个体，其表型并未发生变化；而8个TaWAK4无义或错义突变的个体，表型也由抗病转为感病类型。
五是将外缘TaWAK4基因导入感病品种，看转基因后代的表型变化。无论是将外源TaWAK4的基因组序列或cDNA序列转入感病品种Ct 或Bobwhite， T1代转基因植株抗性分析发现，凡是转入TaWAK4基因的都表现为抗病。综上所述，TaWAK4即为Stb6基因。
最后作者对Stb6基因的组织特异性表达，不同倍性小麦A基因组中的序列多态性，Stb6蛋白激酶结构域的磷酸化特性进行了体外表达测试，以及与病原菌AvStb6互作进行了酵母双列杂交分析。
本文作者沿用了经典的图位克隆的方法成功获得了Stb6基因，相信伴随着越来越多和越来越精确的小麦基因组序列，小麦基因的克隆和验证工作也会变得容易一些。
节后工作第一天，推送该篇文章激励一下广大小麦人，尽快摆脱假期综合症，早早投入到科研中！
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