单细胞测序揭示皮肤伤口中成纤维细胞的异质性

呐，等你关注都等出蜘蛛网了~

不知不觉在单细胞转录组领域做知识分析也快两年了，很幸运聚集了五个小伙伴携手共进，我们承诺不间断更新5个月，把我们这两年的学习成果全部掏出来给大家，包括5个栏目：

1. 文献速递（简短介绍，扩充知识面）

2. 文献详解（图文并茂带来大家系统性学习）

3. R与Bioconductor的技巧（书籍翻译，妙招共享）

4. scRNAseq的GitHub的书籍翻译（原汁原味的名校教程）

5. 全网第一个单细胞转录组视频教程学习笔记分享

现在你看到的是文献速递

希望大家能有所收获！

文章信息

本期文章题目是：Single-cell analysis reveals fibroblast heterogeneity and myeloid-derived adipocyte progenitors in murine skin wounds. 于2019年2月发表于Nature communications .

文章主要对小鼠背部皮肤伤口中的细胞进行单细胞测序(10X Genomics)，对其中的fibroblast进行分群，发现其中一群fibroblast表达hematopoietic markers。对其进行单细胞western blot和单细胞全长测序(Fluidigm公司的C1™)分析以及一些生物学实验验证，发现hematopoietic lineage cells 可以分化成一部分的myofibroblast。

单细胞测

测序数据介绍

• 工具: 10X Genomics

• 测序对象： 对12只Sm22-Cre;tdTomato小鼠皮肤进行全层伤口造模12天（PW12）后，取其伤口内组织，消化成单细胞，进行单细胞测序。对通过质控的21819个细胞进行分析。

• 测序数据：GSE113854

细胞分群分析

• 使用Seurat 包进行聚类分析，分出13个群，根据可能的marker，对不同类细胞进行定性。

• 比对：mm10 reference genome (GRCm38.91) using Cell Ranger Version 2.1.0

• 细胞过滤： 初始测得~22,322个细胞，最后保留的细胞： < 8000 UMI/cell 和< 2500 genes/cell, 线粒体基因表达不多于 8%  ，质控后得~21,819个细胞进行下游分析

• 聚类分析：使用Seruat R包进行聚类分析。表达矩阵→归一化→PCA分析，挑选高变化表达的基因，expression＞0.01, dispersion ＞1.0 → Jackstraw method挑选top40  principle component。

• 做聚类分析 The top 40 PCs were used for clustering with the Louvain modularity-based community detection algorithm to generate cell clusters (FindClusters function, 13 clusters with resolution = 0.45).  

• 确定marker gene：不同类别之间p＜0.01，log(FC)＞0.25 →t-SNE分析。 对伤口中的fibroblast细胞进行再分群也是类似的方法。

其他分析

细胞周期分析

通过参考文献，确定43个G1/S期和54 G2/M期标志基因【Ref29】。使用Seurat中的CellCycleScoring函数来计算。同时用which.cells 进行定量

Pseudotime analyses伪时间分析

通过已知的fibroblast marker gene来进一步分群，用Monocle 2 来推断伪时间轨迹，再进行参考文献中的scEpath【Ref33】方法来确定伪时间依赖的gene表达变化。

RNA velocity analyses

主要分群情况

先将全部细胞分为13个群，其中的C1,C2,C4,C6,C9是fibroblast，

再将其中的fibroblast根据分为12个群

全长单细胞RNA测序

测序数据

工具：使用Fluidigm公司的C1™单细胞全自动制备系统来捕获单细胞并进行单细胞裂解、反转录，使用 Qubit 2.0测量cDNA浓度，≥1.0g可被用于下一步文库构建。

对象：对2-3只Sm22-Cre;tdTomato小鼠皮肤进行全层伤口造模后12天，15天，21天后，取其伤口内组织，消化成单细胞，通过FACS分选进行分选。

数据：GSE113605

备注：这个C1单细胞自动制备系统可同时捕获96个的细胞，在同一张芯片上完成细胞捕获、裂解、逆转录及预扩增的全过程。做这个实验是为了确定表达血细胞marker的fibroblast在伤口后的12，15，21天是否一直存在。用这个方法比较省钱快速。

数据分析

比对和量化

比对：Bowtie（vesion 1.0.0）比对到鼠的基因组（mm10/gencode.Mv13）   ：rsem-prepare-reference –bowtie –gtf

量化：Expectation-Maximization algorithm (RSEM) (version 1.2.31) : rsem-calculate-expression -p $CORES –paired-end.

Samples displaying ≥ 159,000 aligned reads 被用于下游分析

质控

基因表达＞11,000，线粒体基因counts大于15%，基因表达＜3个细胞的全部除去，总共56个细胞被去除，留下总共288个细胞(PW12，116个细胞；PW15，100个细胞；PW21，72个细胞)，进行下游分析。 使用SCnorm归一化。

意义

前人的研究中，成年小鼠皮肤造模大伤口(＞1cm2)后，能够再生毛囊，小伤口(＜1cm2)则没有此能力。对于其中的机制，目前认为经典的WNT信号通路在毛囊再生过程中起主要作用。随着单细胞测序的热度见长，目前单细胞测序也被应用在此领域研究，可用来了解伤口中细胞的成分和小分子，并探究哪些组分在其中其重要作用。

往期精彩

如果你对单细胞转录组研究感兴趣，但又不知道如何入门，也许你可以关注一下面的课程。