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单细胞基因组拷贝数变异流程
主要是上游流程，读文章拿到数据后走标准的比对流程，计算覆盖度测序深度，文章是（2020年4月份）第16周（总第112周 ）- 单细胞基因组测序表明TNBC的CNV发展是爆发式的 http://www.bio-info-trainee.com/4381.html
软件环境安装
首先安装conda
https://mirrors.tuna.tsinghua.edu.cn/help/anaconda/
https://mirrors.tuna.tsinghua.edu.cn/anaconda/miniconda/
wget https://mirrors.tuna.tsinghua.edu.cn/anaconda/miniconda/Miniconda3-latest-Linux-x86_64.sh
bash Miniconda3-latest-Linux-x86_64.sh
source ~/.bashrc
# 安装好conda后需要设置镜像。
conda config --add channels https://mirrors.tuna.tsinghua.edu.cn/anaconda/pkgs/free
conda config --add channels https://mirrors.tuna.tsinghua.edu.cn/anaconda/cloud/conda-forge
conda config --add channels https://mirrors.tuna.tsinghua.edu.cn/anaconda/cloud/bioconda
conda config --set show_channel_urls yes
隔离一个CNV的conda环境来配置软件
conda create -n cnv
source activate cnv
fastqc multiqc trim-galore deeptools qualimap
conda install -y -c bioconda bwa samtools bedtools sambamba sra-tools bowtie2 samblaster
下载参考基因组
这里一步到位下载bowtie2的参考基因组:http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/manual.shtml
wget ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/archive/old_genbank/Eukaryotes/vertebrates_mammals/Homo_sapiens/GRCh38/seqs_for_alignment_pipelines/GCA_000001405.15_GRCh38_no_alt_analysis_set.fna.bowtie_index.tar.gz
# 参考基因组可以不需要下载，上面的索引就足够做比对了。
# wget http://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/hg38/bigZips/hg38.fa.gz
下载文章数据
首先读文章拿到ID号列表，如下：
$head SRR_Acc_List.txt
SRR3080554
SRR3080555
SRR3080553
SRR3080549
SRR3080552
SRR3080613
SRR3080616
SRR3080632
SRR3080615
SRR3080617
然后使用prefetch批量下载，如果你在中国大陆，可能需要加速，自己在生信技能树公众号内搜索如何加速下载sra文件吧。
cat SRR_Acc_List.txt |while read id;do ( prefetch $id -X 100G );done
接着解压下载到的sra文件，这个步骤也可以加速，或者并行。
$dump -A $sample -O $analysis_dir --gzip --split-3 sra/$srr.sra
质控可以继续使用 trim_galore 软件。
使用bowtie2和samblaster一步到位的干净比对
命令很简单
bowtie2 -x $index -U $id | samblaster -e -d $sample.disc.sam -s $sample.split.sam | samtools view -Sb - > $sample.clean.bam
然后根据文章需要对bam文件进行过滤。
发现没有进行sort
批量运行
number1=$1
number2=$2
index=/home/yb77613/reference/index/bowtie/hg38
ls /home/yb77613/data/public/scDNA_TNBC/clean/*gz |while read id
do
echo $id
sample=$(basename $id "_trimmed.fq.gz")
echo $sample;
if((i%$number1==$number2))
then
bowtie2 -x $index -U $id | samblaster -e -d $sample.disc.sam -s $sample.split.sam | samtools view -Sb -q 1 - > $sample.clean.bam
fi ## end for number1
i=$((i+1))
done ## end for $config_file
对bam文件批量构建索引
构建 index的bam需要先sort
ls *.clean.bam| while read id;do(samtools sort -o ${id%%.*}_sort.bam $id);done
ls *.bam |xargs -i samtools index {}
# 实际上可以直接
bowtie2 -x $index -U $id | samblaster -e -d $sample.disc.sam -s $sample.split.sam | samtools view -Sb -q 1 | samtools sort -o ${id%%.*}_sort.bam -
其实还可以去除PCR重复
sambamba markdup --overflow-list-size 600000 --tmpdir='./' -r $sample.bam ${sample}_rmd.bam
对bam文件按照200kb窗口计算表达量
参考生信菜鸟团博客：http://www.bio-info-trainee.com/4452.html
首先拿到基因组坐标染色体坐标
pip install pyfaidx
faidx hg38.fasta -i chromsizes > sizes.genome
然后使用 bedtools 工具基因组染色体坐标进行窗口划分
bedtools makewindows -g sizes.genome -w 200000 > 200k.bed
再依据窗口根据参考基因组进行GC含量计算。
bedtools nuc -fi hg38.fa -bed 200k.bed | cut -f 1-3,5 > 200k_gc.bed
对原始bam文件进行计算
ls ../alignment/*bam |while read id;do (bedtools multicov -bams $id -bed 200k.bed > $(basename $id .bam)_200K_counts.txt );done
对干净的bam文件进行计算
导入R做CNV分析
看GitHub代码即可