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前些天我在生信技能树提出来了一个转录组数据分析的疑难杂症:RNA-seq的fastq文件里面为什么有gc含量的双峰,就是fastq测序数据质量控制的时候发现了GC含量的双峰,然后我简单分析了那些高重复的reads,发现一些是BCA文库,一些是rRNA相关的,所以想到了可以首先去除fastq文件中的rRNA ,就安排学徒去探索一下,过程如下:
从NCBI下载rRNA的fa序列
1.1 打开NCBI,选择“Taxonomy” ,搜索 “Homo“
1.2 点击 Homo
1.3 点击 Homo sapiens
1.4 再次点击Homo sapiens
1.5 右边表格点击Nucleotide的“Subtree links”
1.6 左侧选择rRNA
1.7 下载fasta数据
注意:选择显示200个记录,让所有记录都显示在一页,方便下载全部条目。
另存为:hg38_rRNA.fasta
,这个文件很小,如果大家完成上面的步骤有困难,也可以留言自己的邮箱,我们直接发送这个文件给大家哈。
bowtie2建立rRNA索引
bowtie2-build hg38_rRNA.fasta hg38_rRNA
这个时候的比对工具的选择,并不一定要bowtie2软件哈。
使用 bowtie2
去除rRNA,重点--un-conc-gz
参数。查阅hisat2
的帮助文档,发现有同样的参数,所以可以用hisat2
完成同样的操作。
index=/data/reference/index/bowtie2/hg38_rRNA/hg38_rRNA
bowtie2 -x ${index} --un-conc-gz SRR6236728_rmrRNA.fq.gz -1 SRR6236728_1_val_1.fq.gz -2 SRR6236728_2_val_2.fq.gz -p 6 | samtools sort -o tmp.bam -
rm tmp.bam
bowtie2
运行耗时20min左右,如果是hisat2,可能会更快,大家可以自行测试和比较一下。
去除前后的fq文件比较
上面fq文件包含val标签的是去除rRNA之前的fq文件,包含rmrRNA标签的是去除rRNA之后的fq文件。
下面是不同fq文件的fastqc报告:
可以看到,GC含量最后一个峰是由rRNA导致,因为8百万条reads被去除后,该峰就消失了。
最后剩下的问题,就是GC含量的另外一个峰。我们后续再谈它!