单细胞实验也了解一下？让细胞计数更加准确的7个步骤
The following article is from 联川生物 Author 销售部-卓林钢
单细胞数据处理教程我们已经分享了太多太多，而且也出了专辑介绍单细胞的各个技术原理，但是基本上没有涉及到实验操作本身。首先是因为我们都是生信工程师，不太有机会接触一线实验技术人员。但是科研服务公司可以，他们都是提供一条龙单细胞科研服务。正好几个月前的NGS创新者大会在杭州碰到了联川生物的沈总,说非常希望可以跟我们单细胞天地合作共同推广单细胞技术,就有了这个系列.
对于每种细胞计数方法，样品表面必须是干净的。
任何污染都可能导致不准确的结果。
对于人工细胞计数，这包括移除和清洁玻璃盖片，然后用70%乙醇然后用水清洁计数腔。
当使用一次性塑料载玻片时，每个样品都需要一个新的载玻片(如果载玻片有两个分开的腔室，则需要一对样品)。
在装载样品之前立即进行漩涡震荡处理，是确保被分析样品具有代表性的重要步骤。
不同大小和类型的细胞将以不同的速率沉降和聚集。在加载样品之前立即旋转溶液会增加等分的概率，并准确地反映细胞培养的特性。
细胞计数需要对整个细胞悬液中的少量样本进行分析，因此必须注意确保样品能够代表原始整个单细胞悬液。联川生物使用台盼蓝Countess法和荧光计数Countstar法以及最原始的血球计数板法等多种方法来对细胞活性进行监控和计算。
包括Countstar有采用荧光法，所以像是Countstar这样的细胞计数器应用算法来识别活细胞或死细胞，但它们不能对不具代表性的样本进行校正。
当手动计数时，与单个细胞相比，细胞成团率/结团率的评分更具主观性，从而增加了可变性。细胞裂解后的细胞向外释放的DNA（会造成粘稠结团））和细胞碎片是结团的常见原因。
细胞裂解可能是由于过度生长、过度移液的机械剪切或冷冻/解冻循环等因素造成的，而胰蛋白酶消化不足或过度也可能导致样品的异质性。
目前为了降低细胞结团率，联川生物通过温和细胞裂解的方式来进行尝试，以防止过为剧烈的酶解方式会导致细胞凋亡过快从而释放更多的DNA。如胰酶等需要谨慎使用。
另外对细胞碎片的样本进行过滤，甚至是过滤膜等方式，均可以减少细结团率。
无论是手动计数还是依靠Countess和Countstar等自带软件算法计数，调整焦距和曝光设置都很重要，以确保细胞尽可能有比较好的可见性/能见度，最终获得最准确的细胞计数结果。
最佳的聚焦和曝光将在细胞膜和背景之间，有非常非常非常鲜明的对比。
如上图所示，最佳的聚焦方面，左侧属于正确的聚焦。但是右侧的图为错误的聚焦方式，聚焦不充分。
所以在使用荧光计数之前，条件允许下需要单独优化每个荧光通道的能力，并将产生最具重复性的结果，来检验这种调整优化后荧光细胞计数仪的复现性和稳定性。
实验室应该设置荧光强度，以确保细胞尽可能明亮，同时保持其真实大小-不应该有光从细胞的边缘渗出。
血球计数板有多种型号规格可供选择。不同型号的腔室高度和深度在设计上都差异巨大。实验人员在计算细胞数量时要注意一些细节以避免错误。
大多数自动细胞计数仪都可以调整各种设置参数，以便与正在研究的细胞最佳匹配。
例如，可以设置和保存细胞大小范围，以便将碎片或其他细胞群排除在分析之外。像Countstar等计数仪，可以用PBMC、Vero等细胞作为标准参考。
视野范围内的亮度分析以有效地对培养的哺乳动物细胞进行计数。
然而，即便是使用台盼蓝都很难区分活细胞和死亡细胞，尤其是对许多原代细胞来说，需要使用荧光计数法。
例如，PBMC通常与大量的红细胞混合在一起，通过一般的亮度分析，这些红细胞可能会显示为“死亡”。然而，使用吖啶橙(AO)和碘化丙啶(PI)等染料，可以只对有核的PBMC进行染色，并通过双重荧光区分活细胞和死细胞。
AO和PI都可以对核酸进行染色，但只有AO能够穿过活细胞膜。
最终活的PBMC被AO染色，并呈现荧光绿，死的PBMC同时被AO和PI染色，呈现荧光红。但红细胞没有染色，根本没有发出荧光。
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