CNS图表复现05—免疫细胞亚群再分类

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我们的CNS图表复现之旅已经开始，前面4讲是；

如果你也想加入交流群，自己去：你要的rmarkdown文献图表复现全套代码来了（单细胞）找到我们的拉群小助手哈。

既然我们根据Cells were defined as non-immune if belonging to a cluster low for PTPRC (gene for CD45)的规则，把细胞区分为了免疫细胞和非免疫细胞，详见：我在单细胞天地的教程：是否是免疫细胞很容易区分那是否是肿瘤细胞呢？

现在我们就可以来复现文章里面的免疫细胞亚群再分类了，如下：

免疫细胞亚群再分类

这幅图超级容易理解，就是13431个免疫细胞，可以继续细分为不同的亚群，如上所述。

首先我们挑选免疫单细胞

因为这个是系列连载教程，所以务必看前面的前面3讲是；

知道我是把全部的2万多个细胞的表达矩阵读入R，变成了Seurat对象，然后判断了细胞是否属于免疫细胞哈。前面的代码核心步骤是：

[e-mail]$immune_annotation <-ifelse([e-mail]$RNA_snn_res.0.5  %in% imm ,'immune','non-immune')
# MAke a table 
table([e-mail]$immune_annotation)
phe=[e-mail]
save(phe,file = 'phe-of-immune-or-not.Rdata')

就是把细胞是否属于免疫细胞这个信息（phe=[e-mail]）保存下来了。后面就可以直接使用啦：

rm(list=ls())
options(stringsAsFactors = F)
library(Seurat)
library(ggplot2)
load(file = 'first_sce.Rdata')
sce <- FindClusters(sce, resolution = 0.5)
table([e-mail]$RNA_snn_res.0.5)  
load(file = 'phe-of-immune-or-not.Rdata')
table(phe$immune_annotation)
cells.use <- row.names([e-mail])[which(phe$immune_annotation=='immune')]
length(cells.use)
sce <-subset(sce, cells=cells.use)  
sce

继续走Seurat标准流程之聚类分群

这样就拿到了免疫细胞单独进行后续分析，仍然是走Seurat标准流程之聚类分群，代码是：

sce
sce <- NormalizeData(sce, normalization.method =  "LogNormalize", 
                     scale.factor = 10000)
GetAssay(sce,assay = "RNA")
sce <- FindVariableFeatures(sce, 
                            selection.method = "vst", nfeatures = 2000) 
sce <- ScaleData(sce) 
sce <- RunPCA(object = sce, pc.genes = VariableFeatures(sce)) 
res.used <- 0.7
sce <- FindClusters(object = sce, verbose = T, resolution = res.used)
set.seed(123)
sce <- RunTSNE(object = sce, dims = 1:15, do.fast = TRUE)
DimPlot(sce,reduction = "tsne",label=T)
DimPlot(sce,reduction = "tsne",label=T, group.by = "patient_id")
table([e-mail]$seurat_clusters) 

然后走singleR的自动注释步骤：

sce_for_SingleR <- GetAssayData(sce, slot="data")
sce_for_SingleR
library(SingleR)
hpca.se <- HumanPrimaryCellAtlasData()
hpca.se
clusters=[e-mail]$seurat_clusters
pred.hesc <- SingleR(test = sce_for_SingleR, ref = hpca.se, labels = hpca.se$label.main,
                     method = "cluster", clusters = clusters, 
                     assay.type.test = "logcounts", assay.type.ref = "logcounts")
table(pred.hesc$labels)
celltype = data.frame(ClusterID=rownames(pred.hesc), celltype=pred.hesc$labels, stringsAsFactors = F) 
[e-mail]$singleR=celltype[match(clusters,celltype$ClusterID),'celltype']
DimPlot(sce, reduction = "tsne", group.by = "singleR")
phe=[e-mail]
table(phe$singleR)
save(phe,file = 'phe-of-subtypes-Immune-by-singleR.Rdata')

分群结果的对比

但是我们的这个距离分群结果，跟文章是有一定差异的，如下：

分群是：

> as.data.frame(sort(table(phe$singleR)))
         Var1 Freq
1 Fibroblasts   91
2          DC  170
3     NK_cell  496
4         CMP  551
5 Neutrophils  645
6      B_cell 1957
7  Macrophage 2104
8    Monocyte 2803
9     T_cells 3698

但是它们仍然是可以细分的，如下：

文章是：

简单总结一下，文章把Macrophage和Monocyte合并起来，把B_cell区分成为两群。而我们的T_cells和NK_cell也需要被合并起来。而且 common myeloid progenitor (CMP) 这群细胞呢，在文章并没有出现，不知道是不是会被命名为 Mast-cells，需要相应的生物学背景。

文章给出的代码是；

# Annotate each of the clusters 
free_annotation <- c("T-cells","MF-Monocytes", "MF-Monocytes", "B-cells-PB", "MF-Monocytes", "T-cells", "T-cells", "Neutrophils", "Dendritic", "Mast-cells", "MF-Monocytes", "T-cells", "B-cells-M", "Unknown", "T-cells", "pDCs", "B-cells-M", "MF-Monocytes")
# free_annotation <- c("0","1", "2", "3", "4", "5", "6", "7", "8", "9", "10", "11", "12", "13", "14", "15", "16", "17", "18")

但是我们中间很多步骤都没有精准的模仿文章的各个流程和参数，所以这个时候的差异就没办法解决了，我们是22个群，文章是19个群。

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