空间转录组学和原位测序在阿尔茨海默病研究中的应用
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文章信息
文章题目：Spatial Transcriptomics and In Situ Sequencing to Study Alzheimer's Disease
日期：2020年8月20
期刊：Cell | IF=41.5
DOI: 10.1016/j.cell.2020.06.038
这是关于AD的第一次空间转录组学的相关研究。如下为该文章中涉及空间转录组分析部分的简要笔记，具体可参看原文。
1、实验设计
小鼠模型
AD模型小鼠3月龄、18月龄各2只；6月龄、12月龄各1只；共8只。正常对照小鼠同。
每次取小鼠脑组织3张连续的切片，中间一张用于空间转录组测序、两旁的切片用于免疫组化检测。
对于3月龄、18月龄小鼠，分别取左右脑的冠状切片；对于6月龄、12月龄的小鼠仅取右脑的冠状切面。所以共有20组切片数据。
空间转录组测序
对于每张切片，测序单位为直径100um的TD(tissue domain，可以理解为spot)；平均每个TD测得6578个基因表达信息。
平均每张切片有500个TD，总共10327个TD，共覆盖了14个脑组织区域
免疫组化实验
对于每张切片，共检测4种指标：
Aβ load (6E10 staining) reactive astrocytes (GFAP) presence of neurons (NeuN) nuclei (DAPI)
由于3张连续切片，每张切片10um厚度，因此文章认为可将对应TD的基因表达与免疫组化指标关联起来。
其中对于关键的Aβ load指标，根据TD区域内的荧光信号标准差计算每个TD的Aβ index。
从文章给出数据来看，正常组小鼠的Aβ index均为0。而在AD模型小鼠中，从3月到18月，Aβ index不断增高。
其中在18月龄的AD模型鼠中平均每张切片有1565个 Aβ plaques，平面面积在 78.5–4,950 um2
2、两次差异分析
使用EdgeR包拟合GLM分布，然后进行quasi-likelihood F-test差异分析
2.1 genotype model
3月龄的AD模型鼠与正常对照鼠的TD差异基因 18月龄的AD模型鼠与正常对照鼠的TD差异基因
2.2 Aβ model
研究不同TD的基因表达变化与Aβ index的关系
计算得到的LFC表示每增加一单位的Aβ index，TD中基因表达的变化Log倍数。
同样也是分为3月与18月龄小鼠单独分析。
2.3 通路关联分析
将上述两类差异基因综合考虑(genotype model与Aβ model)，可以反应基因不同层次的表达依赖关系。可进一步将差异基因关联到通路，将通路组成基因的两种平均LFC作为该通路的差异表达特征。
如下左图可以看出Antigen processing, chemotaxis, lysosomal degradation,以及 inflammation通路在18月龄鼠的结果中都具有正的LFC值。
而有意思的是Myelin通路在3月与18月的Aβ model 具有相反的变化，即随着Aβ index的增多，3月龄中该通路正相关；18月龄中该通路负相关。
3、WGCNA分析
对全部的10327个TD做WGCNA分析
选取了Top50%方差(高变)基因，分为了12个模块。每个模块的组成基因见附件Table S3。
WGCNA包分析的相关指标：
(1)Soft power 14； (2)deepSplit = 4; (3)signed network
（1）根据模块的组成基因与cell signature基因集的超几何检验分析，判断每个模块的细胞类型特征。
如下图，是去除了没有任何显著富集或者组成基因数过多的模块。
其中热图中有颜色的第一个格子的上面数字表示交集基因数；中间数字表示预期交集基因数；下面数字表示矫正后的P值
DAM : disease-associated microglia;
A1：inflammatoryastrocytes
（2）取模块组成基因的两类平均LFC，作为该通路的差异表达特征。
如下图所示，Purple与Red的模块差异变化特征最明显。
之后主要关注了与Aβ最相关的red与purple模块。
（3）对red与purple模块内基因的通路富集分析表明
red模块与myelin category相关，在AD的早期活跃、晚期不活跃。 purple模块与chemotaxis, lysosomal degradation, inflammation, antigen processing categories相关。
4、PIG Module
Purple module，57个基因组成，Plaque-induced genes(PIGs)
（1）PIGs模块的两类LFC在18月份都为最大值
如下图A：在genotype model比较中，随着年龄的增长，AD中PIGs基因相较于对照组高表达的程度越明显。 如下图B：在Aβ model中，相较于AD组3月龄鼠，18月龄数各个区域的PIGs基因表达水平都显著增高。
（2）通过GO通路富集分析，发现PIGs基因与经典补体级联、以及与补体级联相关的endocytosis、lysosomal degradation、antigen processing and presentation、immune response、oxidation-reduction富集相关
（3）通过cellular signature的基因集富集分析，发现PIGs基因与DAM/RAM小胶质细胞、A1星形胶质细胞相关。
如下图中标红的为PIGs的hub基因。
activated microglia (disease-associated microglia [DAM] or activated response microglia [ARM]
inflammatory astrocytes (A1)
（3）进一步对PIGs基因，根据正常对照小鼠中的TD做WGCNA分析，分为3个sub module
green cluster组成基因与astroglia-expressed genes相关
blue/orange cluster与microglia相关
根据每个TD的Aβ index大小将AD对照组中的TD分为从高到低分为Q1、Q2、Q3、Q4共4组。
总体来看从对照组到AD组，从Q4到Q1，不同sub module之间的共表达程度增强。具体增强的基因对涉及哪些含义文章有详细论述。
5、OLIG module
Red module，165个基因组成，主要与oligodendrocytes相关(OLIGs)
（1）通路富集分析表明主要与myelin sheath髓鞘相关；cellular signature富集分析、hub基因表明均与少突胶质细胞相关
（2）基因差异分析表明
相比正常小鼠，AD鼠中OLGs基因均显著高表达； 在3月AD鼠中，随着Aβ index增大，OLGs基因表达增多；在18月AD鼠中，随着Aβ index增大，OLGs基因表达反而降低。
在18月中，Genotype正相关，而Abeta负相关
（3）文章进一步发现其实OLGs基因表达在不同年龄段存在不同的脑区域特异性。
在3月AD鼠的FB、TH、HY区域中的TD与Aβ index呈正相关，而ENTI等区域与之呈负相关 在18月AD鼠中AUDs呈负相关，ENTI等区域则呈正相关
（4）按照Aβ index不断增大的Q4-Q1区域划分，比较不同区域的OLGs基因表达水平。
在3月时，观察搭配在Q4~Q2时(mild Aβ index)，随着Aβ的增大，OLGs基因高表达；但是在最高的Q1，则低表达。 在18月份，OLGs基因普遍低表达，可能是由于Aβ index普遍增强相关。
6、结论
plaque-induced genes (PIGs) 模块表征了多种细胞类型的共表达网络关系，尤其是在AD晚期阶段参与了 complement system, oxidative stress, lysosomes, and inflammation等过程。
oligodendrocytegenes(OLIGs)模块基因参与AD早期病变过程，其中主要涉及myelin髓鞘相关通路。
7、数据获取
将文章中所涉及到的所有图片整理、汇总到https://alzmap.org/ 网站中，可供交互式浏览。
将空间转录组基因表达测序数据上传到GSE152506中
文章中所有的图片、测序数据都可在https://www.synapse.org/#!Synapse:syn22153884/wiki/603937 中获取。
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