北京大学药学院刘涛课题组利用非天然氨基酸技术助力基因编辑-提高基因重组效率
▉ 原文信息
▉ 作者简介
今天给大家带来一篇最近发表在 Science Advances(IF=12.804) 上面的一篇文章。文章通讯作者是北京大学药学院的刘涛教授（左）和北京大学第三医院的李默（右）教授。
刘涛，北京大学博士生导师，分子与细胞药理系主任。北京大学百人计划，国家自然科学基金优青。研究方向以蛋白与抗体药物的蛋白质工程，化学修饰与高通量筛选为主，主要技术手段包括基因密码子扩展和分子文库筛选等。以第一作者以及通讯作者的身份在多次在J Am Chem Soc, Cell Chem Biol, PNAS, Angew Chem, J Med Chem, ACSChemBiol等一系列杂志上发表高水平论文。
李默，北京大学第三医院博士生导师；国家自然科学基金委优青。主要从事DNA损伤与癌症发生的分子机制。代表论文包括CancerCell, Cell Research, Nature Chemical Biology, Genes & Development, ScienceAdvances, PNAS, Cancer Research等。
▉ 导读
1. 自基因编辑婴儿发生后，Crispr基因编辑技术在科学以及社会上引起了广泛的关注。提到基因编辑技术，尤其是CRISPR/Cas9，目前已经发展为基因治疗的手段，通过基因剪切治疗给许多种无药可治的遗传病患者带来福音。但是目前用于人体为时尚早，目前该技术还有脱靶等不确定的隐患。但是这并不妨碍该技术正给基础科学研究带来质的飞跃，相信用来治愈疾病的那天将很快到来。
2.下面给大家简单介绍一下该技术。CRISPR (clustered, regularly interspaced, short palindromic repeats)是一种来自细菌降解入侵的病毒 DNA 或其他外源 DNA 的免疫机制。目前，CRISPR-Cas9系统应用最为广泛。Cas9 蛋白含有两个核酸酶结构域，可以分别切割DNA 两条单链。Cas9首先与crRNA及tracrRNA结合成复合物（图A），目前大多都是用基因工程手段对crRNA和tracrRNA进行改造，将其连接在一起得到sgRNA（图B），然后通过PAM序列结合并侵入DNA，得到RNA-DNA复合结构，进而对目的基因双链进行切割，使DNA双链断裂。该系统已经成功应用于细菌、植物、鱼类、酵母及哺乳动物细胞，是目前最高效的基因组编辑系统。
3. 随着该项技术的发展sgRNA与Cas9预组装形成核糖核蛋白(ribonucleoprotein,RNP)，可安全且准确的递送到靶细胞中实现DNA的剪切。随后通过细胞两种方式修复DNA断链，即非同源末端连接(non-homologousend joining, NHEJ)和同源定向修复(homology-directedrepair, HDR)。参照Jinek M et. al. Science 2012; 337: 816–21.。
▉ 前言
1. 导读中的两种修复方式中，非同源末端连接NHEJ是主要途径，该修复过程不需要染色体DNA模板的参与，能够直接重新连接两个断裂的DNA末端，该方式包含反复加工的过程，导致无法准确修复DNA。
2. 目前Crispr介导的精确基因组编辑通常依赖于同源定向修复(HDR)，但是此过程效率较低，因为它需要在Cas9的切割位点存在供体DNA模板。现已经证明，HDR的关键限速步骤单链供体DNA(ssODN)的局部浓度。最近，报道了几种将ssODN引入Cas9-gRNA切割复合体以增强HDR的方法-这些方法利用了生物素-链霉亲和素相互作用以及融合domain和底物相互作用介导的共价键之间的高亲和力结合。然而这些方法有几个缺点：
融合区可能影响蛋白表达和细胞内传递效率，且linker易被蛋白酶裂解 难以从商业来源获得经末端修饰的长ssODNs
ssODN连接位点数量有限，通常发生在Cas9蛋白的N或C末端
3.在本文中，刘涛教授团队使用基因密码子扩展技术对Cas9蛋白进行定点化学修饰，位点特异性的在RNP上招募化学修饰（本文是连接一个DBCO基团）或者未经修饰的寡核苷酸，显著提高了HDR介导的基因组编辑效率，且在人源细胞和小鼠受精卵中进行了验证，这种方法在研究和治疗应用领域具有很大的潜力。
a| 验证含叠氮非天然氨基酸的Cas9蛋白在体外和细胞内的活性
首先作者根据Cas9蛋白的结构选择了11个非天然氨基酸AeF的插入位点（图A）。然后在大肠杆菌BL21中进行表达，得到两个表达产量较高的突变体，分别是Cas9-K1151-AeF和Cas9-G1367-AeF（图B）。并且验证了较高的体外以及细胞内切割效率（图C,D）。
作者首先尝试通过具有环张力的炔烃DBCO与叠氮的环加成反应将DBCO修饰的ssODN共价连接到Cas9-AeF（具有叠氮基团）蛋白上，如图A 所示，ssODN共有186nt，其中36nt编码HiBiT报告标签（图中红色横线），两端各75nt为GAPDH基因的同源序列（图中两条蓝色横线）。HiBiT是一个短肽，能与LgBiT高亲和力结合，在底物furimazine存在下发光，可高敏感度地定量HDR效率。最后结果表明DBCO修饰的ssODN使HDR效率提高了1.6倍。
上述实验虽然提高了HDR的效率，但是不是特别的理想。而且化学修饰gRNA和较长的ssODN都很昂贵，较长的ssODN还会降低偶联效率。于是他们创造性的提出首先利用DBCO修饰的25nt的寡聚核苷酸，先与AeF修饰的Cas9偶联，然后再通过碱基互补配对实现在RNP附近招募较短且经济易得的ssODN来提高HDR效率（图3A）。在体外和细胞内证明了Cas9的活性。最后作者将上述混合物转染HEK293细胞，HDR效率提高10倍（图3D）。该方法也适用于同时连接两个寡聚核苷酸链的情况，HDR效率较单个适配体提高了两倍。
作者利用显微注射技术将蛋白-核酸复合物注入小鼠胚胎中验证了同源重组的发生频率。通过PCR测序可以看到偶联组不管是以低剂量或者高剂量注射都能实现有效提升HDR效率，并且实现精准的插入。
▉ 亮点总结
1.作者通过直接或者间接偶联供体核酸开发了高效，低成本HDR的技术，实现了在细胞以及动物水平的高效，精准修复，具有较大的临床应用前景。
2.利用非天然氨基酸定点插入技术，能够得到同源蛋白偶联物。这是生物医学相关应用中经常需要的，以确保质量控制和活性的一致性。原文引用：https://advances.sciencemag.org/content/6/15/eaaz0051/tab-pdf
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2020-04-22
本文作者王永，北京大学医学部博士在读，微信(id:xs2014233)。目前已经有近400人药学交流群（好学，有趣且奔波于药学圈人才聚集于此）。进群加作者微信或者扫描二维码添加作者，此群仅为科研交流群，非诚勿扰。
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