【一起读文献】Nature Communications： iPSC 神经类细胞的自动培养平台进行AD建模
导 读：
人类诱导多能干细胞(iPSC)神经元和小胶质细胞分化方案的进步允许使用生理相关细胞进行疾病建模。然而，iPSC分化和培养方案对保持一致性提出了挑战。《Nature Communication》期刊近期发表了题为“Improved modeling of human AD with an automated culturing platform for iPSC neurons, astrocytes and microglia”的研究论文，作者团队生成了一个自动化的、一致的、长期培养人类iPSC神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞的平台，并且发现人iPSC小胶质细胞内化并压缩Aβ以生成和包围斑块，从而提供一定的神经保护；Aβ抗体保护神经元免受这些病理损伤，在pTau诱导前最有效。这些结果都表明该模型可以促进靶点发现和药物开发工作。
高通量、自动化 iPSC 衍生的人类神经元培养平台的生成
自动化iPSC衍生的人类神经元培养平台。该工作流程（图1a）始于大批量诱导iPSC神经元分化（1-2亿个细胞），然后将其重新植入384孔成像板中。Fluent®自动化工作站（Tecan）用于多种液体处理步骤，如细胞电镀、培养基更换、实验处理和细胞固定，以实现系统、可重复和精确的神经元处理。然后使用细胞分析仪6000（GE Healthcare）中的自动高含量成像系统对多重染色细胞进行扫描和定量。在两种NSC细胞系（表达NGN2、ASCL1和绿色荧光蛋白（GFP）报告基因）中，Cumate诱导结合细胞周期抑制(PD0332991)在7天内如预期的一样，产生了均匀的iPSC神经元(图1b, c)。神经元分化和复制后，将原代人类星形胶质细胞加入培养中，促进神经元的健康和成熟。Fluent 自动化工作站可保持一致和健康的神经元长达 6 个月（图 1d-j）。自两个 NSC 系的神经元是同质的上层皮层神经元，超过 95% 表达 CUX2，只有 2-5% 表达 CTIP2 或SATB2（图 1k）。神经元还具有广泛的突触连接并表达几个突触前和突触后标记物：PSD95、SHANK、PanSHANK、GluR1、GluR2、vGLUT2、Synapsin1/2、PanSAPAP 和 NR1（图 1l-r）。IN CellAnalyzer 6000 和 ImageXpress Micro Confocal 及其各自的软件用于自动共聚焦图像采集和分析。我们对每孔成像了 9 个视野，覆盖了 70% 的孔区域，捕获了 1000 多个神经元（图 1s）。图像分析脚本提供了对感兴趣标记的精确分割，包括树突 (MAP2)、细胞体 (CUX2)、轴突 (Tau、p-Tau) 和突触 (Synapsin 1/2)（图 1t-y）。为了表征测定性能的可变性，从上述测定的多个批次和实验 (10-20) 计算平均 z 因子（测定可靠性的度量）。它们的范围从 0.5 到 0.7（图 1z），表明检测是可靠的。
图1 高通量、自动化的人类iPSC衍生神经元分化和培养平台
阿尔茨海默病的体外人类神经元模型概括了 AD 病理学特征和动力学
为了研究是否可以在受控的体外人类神经元系统中研究 AD 病理，该团队用合成的 Aβ42 寡聚体处理培养的人类 PSC 衍生神经元，在 4°C 下通过 Aβ42 单体的寡聚化制备（补充图1A)，为了减少 Aβ42 寡聚体制备之间的变异性，优化了寡聚化持续时间并选择了 Aβ42 肽批次，这些批次在治疗后在神经元中表现出一致的 AD 病理：突触丢失、pTau 诱导和 map2 区域减少（补充图 1A-J）。还开发了 Aβ 寡聚体选择性和 Aβ 原纤维选择性 ELISA，以确认寡聚体种类的产生（补充图 1E-G）。并且发现 sAβ42s 诱导的神经毒性对人类神经元具有特异性，用几种不同批次的 Aβ42 寡聚体制剂处理的原代大鼠皮质神经元没有显示树突或突触减少（补充图 1N，O）。
补充图1 sAβ42s 对人类神经元有选择性毒性
与 5μM sAβ42s 一起孵育的神经元显示突触显着丧失、树突减少、轴突断裂、Tau 过度磷酸化 (S396/404) 的诱导以及第 7 天的戏剧性细胞死亡（图 2a-q）。在 AD、S396/404、S217、S235、S400/T403/S404 和 T181 中观察到的几个额外的 Tau 磷酸化位点在用 Aβ42 寡聚体处理时被过度磷酸化（补充图 2V-Z）。通过对 300 nM sAβ42s 可溶性物质的重复处理 3 周，观察到 3R 重复阳性的 Sarkosylin 可溶性部分中的总 tau (HT7) 增加（补充图 2Z）。神经毒性通过与抗 Aβ 抗体以剂量依赖性方式共同治疗而被阻断，表明在本文的体外人类神经元模型中观察到的 AD 病理特征是 Aβ 特异性的（图 2c，h，l，p，r）。使用该定量平台，生成了 MAP2、突触蛋白和 pTau 诱导的抗 Aβ 抗体拯救的半数最大抑制浓度 (IC50)（图 2r）。突触救援是线性的，而 MAP2 和 p-Tau 诱导救援更能表明具有急剧转变的阈值反应。
为了表征可溶性Aβ42物种对神经毒性的动力学和影响，作者进行了一个21天的时间过程实验，单剂量增加sAβ42浓度。观察到sAβ42s神经毒性表型呈剂量依赖性和进行性;更高的剂量导致更快的病理发展和神经元丢失(图2d, e, i, m, q)。最敏感和最早出现的表型是突触丢失;在0.3μM sAβ42s时，突触减少25%，而其他神经退行性标志物未受影响(图2d, e, i, q)。在突触损伤最小的情况下，神经元在21天后可以恢复。有趣的是，树突和轴突减少对sAβ42的神经毒性反应有一个阈值效应，即在1.25μM时，即使突触和CUX2核表达持续丢失，树突和轴突减少也没有影响(图2d, e, m, q)。作者还观察到，pTau的诱导似乎更接近神经元死亡，因为我们无法捕捉到当神经元在高sAβ42浓度下迅速死亡时pTau的初始诱导。这些发现也被概括在第二个iPSC分化的神经元系中，表明这些表型的稳健性。这些数据表明，该模型不仅显示了人类AD病理特征，响应可溶性Aβ42物种，而且还揭示了一系列退化事件，以突触丢失、轴突碎片和树突萎缩开始，随后p-Tau诱导导致严重的神经元丢失(图3o)。
图2 阿尔茨海默病的人类iPSC衍生神经元模型概述了AD病理学的主要特征
为了证明是否能观察到星形胶质细胞增生的现象，该团队的人类星形胶质细胞培养物在特征性星形胶质细胞形态中表达多种星形胶质细胞标志物，例如 GFAP、波形蛋白、ALDH1L1 和 EEAT1（补充图 4A-C）。在与人类 iPSC神经元扩展培养后，观察到越来越复杂的星形胶质细胞分支（补充图 4D）。作为对 sAβ42s 的响应，人星形胶质细胞在单一培养和与神经元共培养中的 GFAP 表达均显示出 2-3 倍的升高（补充图 4E-J）。我们还观察到 GFAP 碎裂增加（补充图 4G 和 J），作者假设其大小可能代表受伤或垂死的星形胶质细胞，因为 GFAP 已被证明在 CNS 损伤期间被半胱天冬酶裂解。
补充图4 sAβ42s上调GFAP表达并诱导GFAP碎片化
iPSC衍生的神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞再现了Aβ斑块的形成
在用 Aβ 寡聚体治疗后观察人类神经元模型中的标志性 AD 病理后，还评估了该模型是否可以重现 Aβ 斑块形成。在 iPSC 衍生的神经元和原代星形胶质细胞存在的情况下，Aβ 聚集结构对 Methoxy-X04 呈阳性，Methoxy-X04 是一种常用的 Aβ斑块结合小分子染料（图 3a）。为了看到由细胞产生的斑块状结构，还对用 Aβ 寡聚体处理的空培养孔进行了染色。 观察到较小的、形态上不同的 Aβ 聚集体，它们是 X04 染料阴性的（图 4a）。 这些不同的聚集体很可能是 Aβ 寡聚体继续寡聚化并从溶液中脱落到培养板上的结果。相比之下，与具有 sAβ42s 的 Hela 细胞孵育不会形成与在人类 iPSC 神经元中观察到的相同的甲氧基-X04 阳性的 Aβ 聚集结构。
进一步鉴定显示，x04阳性A β斑块状结构的一个亚群被营养不良的轴突包围，以神经丝重链(NFL-H)轴突肿胀和磷酸化的Tau (S235)阳性水泡为标志(图3b, c, d，e)。这些结构与人类AD死后大脑切片中观察到的神经营养不良的a β斑块非常相似。重要的是，在第二iPSC-NSC系衍生的神经元中也观察到神经炎斑块样结构，表明这些表型的稳定性。神经炎斑块中淀粉样斑块中的ApoE和营养不良神经突膜中的APP也呈阳性。还在体外AD神经炎斑块状结构中发现了这两种标记物。为了进一步描述这一发现，进行了一个时间过程实验，增加sAβ42s浓度。时间过程分析显示，单个A β斑块增大，并在7天内达到峰值(图3f-l)。Aβ斑块的生长伴随着斑块形成3天后出现营养不良的神经突标记物形态，随着时间的推移而恶化，提示神经元可能是直接暴露于Aβ斑块的反应(图3f-n)。有趣的是，单培养星形胶质细胞也对可溶性Aβ反应，形成大的x04阳性A β结构。它们大且呈纤维状(补充图4E)，不具有典型的压实的神经炎斑块形态。综上所述，在神经元和星形胶质细胞存在的情况下，Aβ42可溶性物种导致x04阳性神经炎斑块形成，导致神经炎营养不良。
图3 人类iPSC神经元形成Aβ斑块，周围有营养不良的神经突起
人 iPSC 衍生的小胶质细胞在神经炎症背景下失去神经保护
AD 病理学的另一个重要组成部分是了解 AD 疾病状态下的小胶质细胞行为。本研究中使用的 iPSC 衍生的小胶质细胞表达已知标志物并表现出典型的分枝形态。它们还能够以剂量依赖性方式在体外产生和包围 X04 阳性 Aβ斑块（图 4c、e）。iPSC 衍生的小胶质细胞受到促炎细胞因子干扰素-γ、白细胞介素 1β和脂多糖刺激通过总 X04 阳性面积和强度测量的斑块形成增加，并且更紧密地包围 Aβ斑块（图 4c，e）。此外，我们观察到小胶质细胞数量增加，如通过离子化钙结合接头分子 1（IBA1）阳性细胞计数测量的，表明小胶质细胞增生反应（图 4f）。
图4 小胶质细胞的激活增加了Aβ斑块的形成，但降低了神经保护作用
聚焦小分子筛选确定 DLK-JNK-cJun 通路抑制保护人类神经元免受 Aβ寡聚体毒性
为了证明筛选能力，并研究观察到的 AD 病理是否保留了先前在 AD 中证明的分子信号事件，对 70 种小分子进行了集中筛选，这些小分子以前已被证明在除 AD 之外的各种神经毒性环境中具有神经保护作用。在双重和三重培养中，在AD 模型范例中以四种浓度测试了这些小分子，因为不同的分子可能具有不同的有效浓度。我们将命中视为在树突面积 (MAP2)、突触计数 (Synapsin 1/2) 或细胞计数 (CUX2) 或轴突面积 (β III 微管蛋白) 的四种测量值中的任何一种中表征≥30% 拯救的分子（图5a-d)。在双重培养中，确认了来自两个筛选的9个具有IC50曲线的结果，包括AD中众所周知的活性激酶抑制剂，例如 DLKi27,GSK3β 和 CDK5 抑制剂和 AZD0530（Fyn 抑制剂 ）。重要的是，GSK3、CDK5 和 Fynare 已知 Tau 作用激酶 。还对两种天然产品木犀草素和姜黄素进行了随访，它们已显示出在 AD中提供保护作用。姜黄素及其衍生物 J147 已通过 IC50 曲线验证40。姜黄素和 J147 目前分别在 I 期和 II 期临床试验中进行研究 。此外，我们从初步筛选中鉴定了多种钙蛋白酶抑制剂，并通过 IC50 曲线验证了盐酸地美环素（图5e-g）。钙蛋白酶以前被确定在 AD中具有活性，并且与 CDK5 信号传导和 Tau 裂解有关。
由于 DLK 抑制是最具保护性的化合物，而且我们还看到 JNK 抑制 (AS601245) 在双重和三重培养的聚焦筛选中也具有保护性，试图验证该途径并调查 DLK-JNK-cJun 信号通路是否是在AD模型中激活。DLK 在神经元中独特表达，当用 Aβ42 寡聚体处理人类神经元时，观察到了 cJun 磷酸化的诱导（图5h，i）。这种效应是持续的（最多 13 天），并且随着可溶性 Aβ42 物种浓度的增加而以剂量依赖性方式增加（图5h-k）。
为了进一步验证这一途径，我们测试了DLK信号通路中几种已知的激酶抑制剂，以确定它们在我们的AD模型中是否也具有神经保护作用。我们观察到，VX-680(一种不同的DLK抑制剂)、GNE-495 (DLK45上游的MAP4K4抑制剂、PF06260933(一种不同的MAP4K4抑制剂)和JNK-IN-8 (JNK1/2/3抑制剂)的抑制作用以剂量依赖的方式对a β进行了神经元保护(图5l-o)。
本文章重点筛选结果是鉴定和验证了几种针对人类AD中几种已知机制的蛋白的化合物，如DLK、GSK3、CDK5和Fyn激酶，所有这些都是目前药物开发中感兴趣的途径。这表明我们的基于人神经元的AD体外模型，不仅展示了之前在体外未见的AD表型，而且还概括了导致这些表型的重要病理信号事件。总之,验证已知的分子信号通路之前证明是重要的药物靶点表明人类体外神经元AD模式是一个转化相关的分子神经生物学和大规模筛选工具,可以促进目标的发现和描述和较大的药物开发工作。
图5：聚焦小分子筛选发现DLK-JNK-cJun通路抑制可保护人类神经元免受a β低聚物的毒性
小胶质细胞淀粉样斑块形成的细胞机制
由于此AD模型系统有力地再现了淀粉样斑块的形成，可以理解斑块形成的细胞过程。为了观察小胶质细胞的斑块形成，我们对小胶质细胞进行了间隔30分钟、持续7天的延时研究，并将其与类似的细胞类型:人cd14来源的巨噬细胞进行了比较。利用hilyte -555标记的Aβ42单体生成红色可溶性Aβ42物种(补充图8)。与巨噬细胞相比，小胶质细胞在斑块形成期间和之后具有独特的高运动能力，它们的突起可伸缩，并动态地进出斑块。Aβ斑块形成似乎形成细胞外的小胶质细胞簇，并逐渐变大。相比之下，人类巨噬细胞相对稳定并持续内化红色sAβ42。将pHrodo®绿色染料掺入hilyte555标记的低聚体中，以便同时观察Aβ42内化(绿色)和斑块形成(红色)(图6a），发现小胶质细胞在斑块形成之前首先内化sAβ42(图6b, c)。这些结果表明，小胶质细胞可能首先内化可溶性Aβ42物种，然后将其外吐并包装成斑块结构。
为了进一步证实时间推移的结果，进行了免疫染色的时间过程研究。观察到小胶质细胞在30分钟内吸收sAβ42s(图6d)。6 h后，小的内化斑点消失，在每个细胞附近的边缘出现较大的、微弱的X04阳性的Aβ42聚集物(图6d)。1天后，在小胶质细胞旁观察到更大的Aβ42聚集物，其X04染色强度更高，并且这些聚集物周围开始出现更多的小胶质细胞。第4天，周围小胶质细胞出现x04 -染色阳性斑块结构。这种行为似乎是小胶质细胞特有的，因为人巨噬细胞似乎持续内化sAβ42s，然后出现死亡。最后，为了测试是否与内吞作用有关，小胶质细胞被动力蛋白抑制剂处理，以减少内吞作用。我们发现，斑块的形成减少了75%，这表明a β42小胶质细胞内化对淀粉样斑块的形成至关重要。
图6 人iPSC小胶质细胞内化可溶性 Aβ 物质以形成细胞外斑块
模拟AD进展和抗 Aβ 抗体干预
高单剂量 sAβ42s (5μM) 虽然在 7 天内显示 Aβ42s 表型，但可能不是生理性的，在延长的时间内可能存在较低的 Aβ42 寡聚体升高。 为了模拟 AD 的进展和持续的 Aβ 暴露，在整个 21 天的时间进程研究中，在培养基以多种浓度 (0.3–5μM) 变化后，每周两次系统地将重复剂量的 Aβ 寡聚体添加到神经元/星形胶质细胞培养物中。 与单次暴露相比，重复低剂量的 Aβ42 寡聚体导致神经元毒性延长、增加（图 7a-c)。本文中选择了 0.625μM 的重复剂量来模拟 AD 进展，需要 21 天才能导致细胞死亡。
如前所述，在 Aβ 暴露开始时（预防性地）添加高浓度的抗 Aβ 抗体具有保护作用。然而，在临床环境中，在治疗干预时已经发生了一定程度的神经元损伤。通过创建抗体干预模型来测试当 Aβ 诱导的神经毒性在治疗前发生时抗 Aβ 抗体治疗是否有效，其中在不同长度的 sAβ42s 暴露后开始抗 Aβ 治疗（图7d）。在疾病进展过程的三分之二左右有一个窗口，其中抗 Aβ 抗体治疗可以在树突、突触和 pTau 诱导中提供神经保护（图 7e-g）。pTau 诱导的保护窗口比突触蛋白短（分别为 7 天和 14 天），表明抗 Aβ 抗体可能在 pTau 诱导之前最有效。此外，当神经退行性变加速时干预窗口缩短通过使用每两周剂量增加的 sAβ42s（补充图 10）。
接下来，对MAP2区域进行时间过程分析，以衡量神经元健康状况(图7h-k)。与对照抗体相比，抗a β抗体减少了神经退行性变和斑块形成的进展(图7i-k)。这些数据表明，此AD模型可以通过调节产生一个精确控制神经退行性变速度的进展性AD疾病模型，评估了抗Aβ抗体的神经保护能力，并证明早期干预可以提供更大的保护，这与该领域目前的共识一致。
图7 疾病进展模型揭示了抗 Aβ 抗体的早期疗效窗口
抗Aβ抗体通过将Aβ寡聚体保持在可溶性上清液中来保护神经元
接下来，作者团队试图解决抗Aβ抗体如何在小胶质细胞、神经元和星形胶质细胞的完整三培养系统中提供神经元保护。检测了小胶质细胞存在或不存在时抗gd抗体，以了解小胶质细胞的基线保护作用，观察到对神经突触和树突的保护作用约为25-40%(图8a, b)。抗Aβ抗体在小胶质细胞存在时保护作用增强，提示小胶质神经保护和抗a β抗体保护是添加剂(图8a, b)。与具有效应或无效应功能的抗体比较，没有显著差异，提示抗体效应功能可能在该模型中没有发挥作用。
为了确定神经炎症环境是否影响小胶质细胞存在时的抗体保护，添加了促炎细胞因子IFNγ、IL-1β 和LPS来激活小胶质细胞，并测量神经元健康(MAP2)和斑块形成(甲氧基- x04)。对照，抗gd抗体，重复了之前的观察(图5g-i)，即在神经炎症状态下小胶质神经保护丧失(图8c)。有趣的是，发现抗a β抗体在两种情况下都具有保护作用，IC50曲线右移可能是由于小胶质细胞保护的丧失(图8c)。
由于假设抗Aβ抗体的作用机制是与Aβ结合，我们假设sAβ42仍溶解在上清液中，与抗体结合，并在这种状态下中和对神经元造成毒性。对含有5μM s Aβ42s的上清液进行分析，发现抗Aβ抗体增加了上清液中可溶性Aβ，减少了板结合态Aβ(图8e)。小胶质细胞存在时，上清液中的可溶性Aβ减少，这可能是由于斑块形成增加(图4c)或小胶质细胞内吞和清除作用。但随着抗体浓度的增加，上清液中Aβ增加到最初输入的5μM。这表明抗Aβ抗体结合和溶解Aβ，减少与神经元和小胶质细胞的接触，从而实现独立于小胶质细胞的神经元保护，这与观察到的抗Aβ抗体治疗导致斑块形成减少相一致(图8d, e)。
图8 抗Aβ通过保持Aβ在上清液中可溶来保护神经元，不需要抗体效应器功能
小 结
精读请下载原文：
Improved modeling of human AD with an automated culturing platform for iPSC neurons, astrocytes and microglia.Nat Commun. 2021 Sep 1;12(1):5220. doi: 10.1038/s41467-021-25344-6.
END
编 译 / 张妙萍
审 校 / 蔡玉洁
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