凌波微课|微生物组多样性研究新热门——16s rDNA全长扩增子测序

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16s rDNA全长扩增子研究

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相信主攻微生物领域研究的老师们或多或少都接触过16s rDNA扩增子测序技术。伴随着二代测序技术的发展，这套基于特征区域（marker gene）测序进行微生物群落物种识别和群落结构研究的技术在微生态研究领域中获得了非常广泛的研究及应用。由于这个技术通量高，周期短，操作灵活且成本低廉，受到了各行各业微生物组领域研究的热烈“追捧”。但时间长了，有的老师也陷入的困惑——

我的好友G老师就遇见了类似的问题，再做了6-7年的扩增子测序之后，有一天他终于忍不住问我，我的结果中好多物种鉴定不到种水平，可咋整啊！？相信上面的这些问题，很多老师和同学们都有同样的疑问~~今天线条姐就给大家安利一款微生物组研究新热门技术——16srDNA全长扩增子测序。

首先来看看，什么是16s全长测序，它与我们之前基于NGS平台开展的扩增子研究差别在哪儿？

微生物群落研究中，会有数量及种类众多的微生物，他们的核酸混杂在一起，我们是很难通过实验手段实现分离的。扩增子测序技术就是针对其上具有物种特异性的序列进行测序，其中，细菌物种的研究比较多关注的是编码细菌核糖体16srRNA的序列，这段序列保守区夹杂着9个高变区构成（下图），不同物种的高变区具有较大差异，因此可作为物种识别的特征性序列开展研究。

既往研究中，受限于NGS的读长，PE300模式下，也仅能获得600bp以内的片段读取，而16s rDNA全长约1500+bp，因此基于NGS测序只能对其中的个别高变区域开展。伴随着三代测序技术的发展，长度长测序技术越来越成为组学研究的主流。Pacbio平台3-5kb的平均读长可以轻而易举地覆盖16s rDNA的9个高变区域，获得的序列更长，信息量也更多！16s rDNA全长测序因此成为多样性研究的新热点技术。

那为什么要推荐这个技术呢？这里就要聊一聊扩增子测序技术研究的关注点：物种鉴定的精确度、灵敏度、是否存在偏好性，能多大程度还原群落结构的真实情况等等。这些，都是微生物组技术关注的核心问题。既然如此，基于NGS技术的 的部分区域研究和基于三代测序技术的全长研究之间，就要一决高下了！

Round 1

有研究者比较了一代到三代平台在微生物组研究领域各自的优缺点(下表)。

一代自不必说了，繁琐的实验，缓慢的周期和昂贵的费用都成为限制其应用的瓶颈。但在二代和三代比较中，Pacbio平台可实现16s全长研究需要，同时兼具时间短，无需扩增等优势，伴随着三代测序成本的下降，势必成为取代二代测序，提升研究品质的必经之选。

从分类鉴定的状况看（下表），基于三代测序，在同一分类水平下，也可以实现更多的物种分类，更是在种水平物种鉴定中实现了大幅提升，这一点就很大程度满足了微生物学研究者的迫切需求。

Round 2

比对了样本中微量物种的分类识别情况和偏好性。从下图不难看出，基于三代技术开展16s全长扩增子研究，有更多的序列得到了明确的物种划分，尤其是针对样本中含量低微的物种，分类鉴定的效果更好。

此外，由于二代测序建库过程中有PCR扩增的步骤，难以避免由于扩增偏好性造成的物种丰度检测的偏差。在多个研究中，人们都发现基于二代测序部分高变区的研究，可能造成某些特定微生物类群含量的检测偏差（下图），这就难以实现对样本中微生物群落分布的真实还原。而三代测序由于不需要PCR的过程，就很大程度上降低了结果的偏差。

Round 3

19年有学者在NC上报道了基于16s不同高变区和16s全长研究的差异。基于数据库已有信息和计算模拟，评价了不同区域引物在物种识别和还原样本信息上的差异。下图展示的是扩增子序列不能被识别的序列比例。

不难看出V1-V9区引物很少有序列不能被明确分类，相比之下，仅仅开展V4区的研究，则有极高比例的序列无法实现明确分类。

底下这张物种进化树分析，则通过颜色变化很好的说明了这一点。基于模式物种库进行进化树构建，并用红色表示其中不能被明确鉴定的物种，亦可看出，基于部分区域的V4区研究，有很大比例的物种无法实现明确分类。此外，由于研究区域的选择，在一定程度上也造成了分类识别的偏好性。例如，有报道V1-V3区更适用于埃希氏菌和志贺氏菌的分类，而V3-V5区则对克雷伯菌分类效果较好~

通过聚类OTU，并与模拟物种库进行比较，研究者还发现，V1-V9区研究实现了对样本的最佳还原（下图），物种的识别和定量是最接近模拟物种库原貌的，这一点说明了基于三代平台的16s全长测序在保真效果上的巨大优势。

此外，在进行真实的粪便样本研究中，研究者发现，利用三代16s全长扩增子测序技术可以清晰的获得菌株在16s全长范围内的单核苷酸变异信息（下图）。利用这样的信息，可以更好地对菌株实现区分。在这个研究案例中，研究者对某菌株在不同样本中的多态性进行了描述，同时，基于数据库中近源菌株的多态性比对，可以获得详尽的菌株分类信息。这也是16s全长测序的一个技术特色。

由此可见，基于三代测序技术的16s全长扩增子测序可谓好处多多！这么好的技术，一定很贵吧！

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