前沿！CAR-T细胞免疫疗法最新研究进展
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谷 君 说
近年来，CAR-T免疫疗法除了被用来治疗急性白血病和非霍奇金淋巴瘤之外，经改进后，也有望用来治疗实体瘤、自身免疫疾病、HIV感染和移植排斥等疾病，让我们一起看看这个领域取得的最新进展。
CAR-T细胞免疫疗法
文/towersimper
CAR-T(Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy)，即嵌合抗原受体T细胞免疫疗法。
该疗法是一种出现了很多年但近几年才被改良使用到临床中的新型细胞疗法。
在急性白血病和非霍奇金淋巴瘤的治疗上有着显著的疗效，被认为是最有前景的肿瘤治疗方式之一。
图1. CAR-T细胞免疫疗法示意图，图片来自Frontiers in Immunology, doi:10.3389/fimmu.2016.00353.
这种新的治疗策略的关键之处在于构建一种被称作嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor, CAR）的人工受体来特异性地识别在癌细胞表面上表达的抗原，如B细胞恶性肿瘤的CD19、CD20和CD22，胶质母细胞瘤的EGFRRVIII。
CAR由一段胞外单链抗原可变区片段（scFV）、跨膜区和胞内信号区3个部分组成。
第一代CAR将scFV区与激活抗原特异性T细胞的CD3ζ胞内信号区连接。
之后开发的CAR包含了额外的共刺激信号（CD28、4-1BB和OX40，第二代CAR包含其中的一个，第三代CAR包含其中的两个）来增强和维持T细胞功效。
然而，患者的T细胞本身并不表达这种CAR，毕竟它是一种人工受体，是特异性地针对癌细胞表面上存在的抗原人工设计出来的。
在人体临床试验中，科学家们通过一种类似透析的过程提取出病人体内的一些T细胞，然后在实验室对它们进行基因修饰，将编码这种CAR的基因导入，这样这些T细胞就能够表达这种新的受体，如图1所示。
这些经过基因修饰的T细胞在实验室进行增殖，随后将它们灌注回病人体内。
这些T细胞利用它们表达的CAR受体特异性地结合癌细胞表面上的抗原上，从而触发一系列信号转导事件，最终强效地摧毁体内的癌细胞。
2017年，FDA批准了两种CAR - T细胞产品上市——诺华公司(Novartis)的Tisagenlecleucel和Kite的Axicabtagene Ciloleucel，分别用于治疗儿童和年轻人B细胞急性淋巴细胞白血病（ALL）和成人复发或难治性大B细胞淋巴瘤患者。
近年来，CAR-T免疫疗法除了被用来治疗急性白血病和非霍奇金淋巴瘤之外，经改进后，也有望用来治疗实体瘤、自身免疫疾病、HIV感染和移植排斥等疾病，让我们一起看看这个领域取得的最新进展。
2018年11月，Sophie Viaud等人构建出一种带有基于抗体的开关的CAR（switchable CAR, sCAR）T细胞系统。
这种sCAR-T细胞系统由一种CD19开关（小鼠CD19靶向抗体的抗原结合片段[Fab]与一种肽新表位的融合物）和一种相应的sCAR（带有能够识别这种肽新表位的一种单链抗体的可变片段[scFv]）组成，允许根据需要对sCAR-T细胞活性进行控制。
他们证实在小鼠模型中，这种sCAR-T细胞系统可在次级淋巴组织内产生一个持久的sCAR+ CD8+ 中枢记忆T细胞群体，从而导致持久的抗肿瘤应答。
图2.构建sCAR-T细胞系统及其体外活性研究，图片来自PNAS, doi:10.1073/pnas.1810060115。
2018年11月，Xingjian Gu等人通过将单载体Tet-on系统整合到CD19CAR构造体中，构建出诱导型CD19-CAR（inducible CD19CAR, iCAR19）T细胞。
这种iCAR19-T细胞表现出四环素衍生物强力霉素（Doxycycline, Dox）依赖性的细胞增殖、细胞因子产生、CAR表达和较强的CD19特异性细胞毒性。
他们发现这种这种iCAR19-T细胞在具有强大的抗肿瘤效果的同时也具有较强的安全性。
他们已利用这种iCAR19-T细胞开展动物实验和临床前实验，并期望明年开展人体临床试验。
2018年11月，比利时细胞治疗公司Celyad在第33届癌症免疫治疗协会（The Society for Immunotherapy of Cancer, SITC）年会上，公布了CAR-T细胞疗法CYAD-01治疗实体瘤的THINK 1期临床试验数据。
其中与目前开发的其他CAR-T细胞疗法不同的是，CYAD-01（CAR-T NKG2D）疗法是独特的。
这是因为它靶向的NKG2D受体具有结合8种不同配体的能力，在绝大多数癌细胞类型中，这些配体由癌细胞天然表达，覆盖了80％的血液肿瘤和恶性实体瘤。
在这项临床试验中，14名患有复发/难治性疾病的患者：
11名转移性结直肠癌患者、2名卵巢癌患者和1名胰腺癌患者接受三种不同剂量（每次注射300万个细胞、10亿个细胞和30亿个细胞）的CYAD-01治疗。
接受最高剂量治疗的患者表现出临床活性（疾病稳定或更好）的迹象，因而适合接受第二轮治疗。
根据RECIST 1.1标准，总共有4名患者表现出确定的病情稳定（3名转移性结直肠癌患者和1名卵巢癌患者）。
作为单一疗法，CYAD-01具有良好的耐受性。
2018年11月，Jeffrey Rathmell及其团队发现谷氨酰胺会启动一种代谢信号通路，这种通路增强介导抗病毒反应和抗癌反应的T细胞功能，并且抑制参与炎性疾病和自身免疫疾病的T细胞的功能。
他们在接受CAR-T细胞免疫疗法的小鼠模型中使用了一种抑制谷氨酰胺酶的抑制剂。
结果发现这种谷氨酰胺酶抑制剂能够增强CAR-T细胞的功能，并且CAR-T细胞能够持续存在更长的时间。
图3.图片来自Cell, doi:10.1016/j.cell.2018.10.001。
2018年10月，Marco Ruella等人报道了一名B细胞急性淋巴性白血病患者接受了一款成熟的CAR-T疗法，他的病情快速地得到控制。
后续的研究也表明，他体内的CAR特异性序列有保持在较高的水平，然而奇怪的是，细胞计数结果表明这些CAR特异性序列的增加似乎与CAR-T细胞的数量无关。
进一步的分析结果表明这些CAR特异性序列竟来自癌细胞。在治疗短短9个月后，这名患者的白血病突然复发，而且由于病情过量，他最终去世了。
这些研究员猜测很可能是这些CAR特异性序列在CAR-T疗法制备期间进入到癌细胞中。
2018年8月，Sarwish Rafiq等人构建出两类新型CAR-T细胞：一类靶向在某些血癌细胞中表达的CD19抗原，另一类靶向在某些卵巢癌和胰腺癌等实体瘤中表达的MUC16抗原。
接着，通过基因改造，将一种抗PD-1抗体的简化版本---单链抗体可变区片段（scFv）---的编码基因导入到已经构建好的 CAR-T 细胞中，这样经过基因改造后的CAR-T 细胞就能够分泌scFv。
他们发现在实体瘤和血癌的多种小鼠模型中，这两类新型CAR-T细胞在体内存留时间更长，疗效更好。
更重要的是，由于免疫检查点抑制剂scFv在癌症附近释放，它们能够激活癌症附近的T细胞，从而招募患者自身的T细胞一起来杀伤癌症。
再者，血液中具有很低的scFv水平，这表明这种免疫检查点抑制剂没有扩散到离癌症很远的地方，这样就能够降低全身性的副作用。
2018年8月，Deepak Raj等人构建出一种带有开关的CAR-T细胞（sCAR-T细胞），这种sCAR-T细胞靶向在癌细胞中高表达但在正常细胞中低表达的抗原HER2。
他们还发现这种sCAR-T细胞可有效地抵抗来源自晚期胰腺导管腺癌（PDAC）患者的侵袭性肿瘤及其转移灶。
同时还可通过控制sCAR-T细胞的活性来降低对正常组织的毒副作用。
图4.带有开关的CAR-T细胞示意图，图片来自Gut, doi:10.1136/gutjnl-2018-316595。
2018年8月，Stanley Riddell及其团队研究了利用两种最常用的共刺激结构域构建出的两种CAR设计---CD28和4-1BB---之间的差异。
他们发现这两种类型的CAR都引发了相同的信号转导通路激活，但是在信号的时间选择和强度方存在着差异：CD28 CAR设计显示出更快更强的活化，而4-1BB CAR显示出更慢更温和的激活。
在淋巴瘤小鼠模型中的进一步测试结果表明4-1BB CAR在清除癌细胞方面更有效。
他们还发现：一种被称作Lck的信号蛋白调节着CD28 CAR引发的T细胞反应的强度，而且他们能够对它加以操纵来微调CD28 CAR引发的T细胞反应。
4-1BB CAR-T细胞显示出更高的与T细胞记忆相关的基因表达，这提示着4-1BB CAR信号转导可能产生能够存活更长时间并且维持抗癌作用的T细胞。
2018年5月，Joseph A. Fraietta报道了一名慢性淋巴细胞白血病（CLL）患者在2013年接受CAR-T细胞疗法后因单个CAR-T细胞及其增殖时产生的细胞而发生病情缓解，从那以后在5年内保持无癌症状态，并且这些CAR-T细胞仍然存在于他的免疫系统中。
他们还证实这种治疗反应与CAR编码基因插入到这名患者的T细胞DNA中的位置相关联。
具体而言，就CAR编码基因插入到调节血细胞形成的TET2基因中，从而破坏这个基因，结果就是CAR-T细胞就会大规模扩增，从而最终清除这名患者体内的白血病。
2018年5月，Miriam Y. Kim等人利用新一代基因编辑工具CRISPR/Cas9移除了健康的造血干细胞中的CD33分子，缺失CD33的健康造血干细胞同样能够发挥正常功能，这样就使得CD33称为白血病细胞的唯一标志物，
随后利用CAR-T细胞疗法就能够轻松识别并且攻击这些白血病细胞。
他们已在小鼠和猴子模型中证实了这种新型疗法的效果，而且在实验室环境下也已经在人类细胞中得到了可喜的结果。
CAR-T细胞免疫疗法尽管在治疗血液肿瘤中有巨大的希望，但是同时也存在较大的副作用。
CAR-T细胞免疫疗法带来一个巨大的临床风险就是细胞因子风暴。
当CAR-T细胞快速杀死癌细胞时，产生的大量细胞因子会对宿主其他组织器官发起惊人的攻击，导致高烧、低压、休克甚至死亡。
此外，血液肿瘤仅是癌症中的一小部分。
作为癌症中的大头，实体瘤远比血液肿瘤复杂得多。
尽管初步研究已表明CAR-T细胞免疫疗法在实体瘤方面具有不错的安全性和有效性。
但是接受治疗的患者也会出现败血症、气短和白细胞水平升高等副作用，对实体瘤的治疗似乎并没有想象中的那么乐观。
近年来，随着基因组测序技术、RNA测序技术DNA微阵列技术和多基因RT-PCR定量检测方法的不断发展，人们对癌症的认识也逐渐深化，就有可能找到更多的更好的可适合作为CAR-T细胞免疫治疗靶标的癌症表面抗原。
除了对CAR-T细胞本身进行改进之外，优化CAR-T细胞运送方法或者将CAR-T细胞免疫疗法与现有的疗法联合使用为成功地利用CAR-T细胞治疗癌症带来了希望。
参考文献：
1. Sophie Viaud et al. Switchable control over in vivo CAR T expansion, B cell depletion, and induction of memory. PNAS, 13 November 2018, 115(46):10898-10906, doi:10.1073/pnas.1810060115.
2. Xingjian Gu et al. Development of Inducible CD19-CAR T Cells with a Tet-On System for Controlled Activity and Enhanced Clinical Safety. International Journal of Molecular Sciences, November 2018, 19(11):3455, doi:10.3390/ijms19113455.
3. Celyad Presents Update on CYAD-01 Solid Tumor Clinical Program at the SITC 33rd Annual Meeting
https://www.businesswire.com/news/home/20181109005430/en/Celyad-Presents-Update-CYAD-01-Solid-Tumor-Clinical
4. Marc O. Johnson, Melissa M. Wolf, Matthew Z. Madden et al. Distinct Regulation of Th17 and Th1 Cell Differentiation by Glutaminase-Dependent Metabolism. Cell, Published Online: 01 November 2018, doi:10.1016/j.cell.2018.10.001.
5. Marco Ruella et al. Induction of resistance to chimeric antigen receptor T cell therapy by transduction of a single leukemic B cell. Nature Medicine, October 2018, 24(10):1499–1503, doi:10.1038/s41591-018-0201-9.
6. Sarwish Rafiq et al. Targeted delivery of a PD-1-blocking scFv by CAR-T cells enhances anti-tumor efficacy in vivo. Nature Biotechnology, Published Online: 13 August 2018, doi:10.1038/nbt.4195.
7. Deepak Raj et al. Switchable CAR-T cells mediate remission in metastatic pancreatic ductal adenocarcinoma. Gut, Published Online: 17 August 2018, doi:10.1136/gutjnl-2018-316595.
8. Alexander I. Salter, Richard G. Ivey, Jacob J. Kennedy et al. Phosphoproteomic analysis of chimeric antigen receptor signaling reveals kinetic and quantitative differences that affect cell function. Science Signaling, 21 Aug 2018, 11(544):eaat6753, doi:10.1126/scisignal.aat6753.
9. Joseph A. Fraietta, Christopher L. Nobles, Morgan A. Sammons et al. Disruption of TET2 promotes the therapeutic efficacy of CD19-targeted T cells. Nature, Published online:30 May 2018, doi:10.1038/s41586-018-0178-z.
10. Miriam Y. Kim, Kyung-Rok Yu, Saad S. Kenderian et al. Genetic Inactivation of CD33 in Hematopoietic Stem Cells to Enable CAR T Cell Immunotherapy for Acute Myeloid Leukemia. Cell, 31 May 2018, 173(6): 1439-1453, doi:10.1016/j.cell.2018.05.013.
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