世界首例！《细胞》子刊：中国科研团队成功在猪体内培育出人类肾脏
我国器官移植存在巨大供需缺口，每年有约30万人等候器官移植。长期以来，科学家们一直试图通过使用动物器官来解决器官资源短缺问题，生物谷近期就报道过，转基因猪的肾脏可在人体内正常运转一周的相关研究。《猪猪立大功！JAMA子刊：猪肾脏可在人体内正常运转一周，异种器官移植再获重大进展！》
免疫组织相容性供体的短缺是器官移植中普遍存在的问题。目前很有前景的一种替代方案是通过胚胎与多能干细胞（PSCs）互补技术，在大型动物体内产生人类器官（专业术语：种间嵌合体 interspecies chimeras）。科学家已经在小鼠和大鼠中，成功培育出人胰腺、胸腺和肾脏等器官。鉴于猪在生理学、器官大小以及胚胎发育方面与人类高度相似，因此猪是制造人类器官的一款理想“孵化器”。
然而，在啮齿类动物以外的哺乳动物中，制造种间嵌合体一直是一项难度极高的挑战。中国科学院广州生物医药与健康研究院的赖良学研究员、戴祯研究员、Miguel A. Esteban研究员以及潘光锦研究员历经5年的攻坚克难，在猪胚胎中成功培育出人-猪嵌合中期肾脏结构，相关成果于以《Generation of a humanized mesonephros in pigs from induced pluripotent stem cells via embryo complementation》为题目，于2023年9月7日以封面形式发表于Cell子刊Cell Stem Cell杂志上。这也将是人类借助生物工程技术解决供体器官短缺这一世界难题的重要一步。
（doi: 10.1016/j.stem.2023.08.003）
第一步：制备4CL/N/B人多功能干细胞
选择合适的培养体系，是制造多功能干细胞的关键，科研团队比较了mTeSR1、4CL, RseT（HENSM）、PXG、5iLA等5种培养基，通过将DsRed（一种红色荧光标记物）标记的多功能干细胞注射到猪胚胎后，发现4CL是最适合用于下一步实验的培养基。
课题组曾报道，同时过表达MYCN和BCL2两个基因 (缩写：N/B)，可以大大增强小鼠、兔和猪胚胎的生态位竞争力。因此，课题组在4CL培养条件下，在人多功能干细胞中过表达N/B基因，尝试提高干细胞的生存力。实验结果也证实，4CL/N/B联合作用可以产生最高程度的嵌合能力。
制备4CL/N/B人多功能干细胞流程及验证
（doi: 10.1016/j.stem.2023.08.003）
第二步：制备肾脏有缺陷的猪胚胎
已有研究表明，通过基因工程手段在特定组织中削弱细胞竞争，可以制造出在器官形成方面有缺陷的动物。SIX1和SALL1基因在猪中肾和后肾中均有表达，对中肾小管的形成和输尿管芽的侵袭过程至关重要。研究团队运用基因编辑技术（CRISPR-Cas9），在猪胎儿成纤维细胞外显子1中敲除SIX1,然后通过体细胞核移植制备SIX1敲除的猪胚胎。在此基础上，进一步敲除SALL1，制备出SIX1和SALL1双基因敲除的猪胚胎。这种特定的胚胎具备一定的肾脏缺陷，为后续人多能干细胞的生长和分化提供了必要的胚胎互补环境。
制备SIX1和SALL1双基因敲除猪胚胎的示意图
（doi: 10.1016/j.stem.2023.08.003）
第三步：制备人源化猪肾脏
制备人源化猪肾脏的基本流程图
（doi: 10.1016/j.stem.2023.08.003）
科研团队将共计1820个注射了DsRe标记的4CL/N/B 诱导多功能干细胞的胚胎转移到13只代孕猪体内，根据伦理相关规定，在胎龄25至28天后终止妊娠。在胎龄25天收集到两个正常胚胎和四个退化胚胎，在胎龄28天收集了三个正常胚胎。免疫荧光检测显示，DsRed标记的细胞仅出现在中肾区域。HE染色也证实，嵌合体的中肾表现出与野生型胚胎相似的组织学结构。
中肾区域的免疫荧光染色结果
（doi: 10.1016/j.stem.2023.08.003）
HE染色结果显示，胎龄28天嵌合体的中肾小管发育正常。
（doi: 10.1016/j.stem.2023.08.003）
展望与不足
本项研究成果证明了基于种间胚胎补偿技术在异种大型动物体内再造人源化器官的可行性，对解决器官移植领域供体器官短缺的难题具有重要意义，但依然有一系列瓶颈有待克服：
（1）退化猪胚胎的总体比例很高，体细胞核移植克隆猪的效率不高；
（2）未来如果运用于脑细胞和生殖细胞，面临着严重的伦理问题；
（3）器官由多种细胞组成，如果器官的血管细胞来自猪供体，移植以后可能会引起器官排斥反应。
研究团队在还指出，本项研究还存在一些明显的不足之处：
（1）需要进一步的研究来阐明，嵌合体中整的人类细胞是否与野生型猪中肾单位的发育状态一致；
（2）优化多能干细胞的制备过程（外源因素、培养条件或注射程序），可能促进嵌合能力提升；
（3）运用单细胞测序技术，研究不同发育阶段，供体细胞在胚胎中的动态变化。
期待中国科学院广州生物医药与健康研究院科研团队的后续进展！
参考文献：
https://www.cell.com/cell-stem-cell/fulltext/S1934-5909(23)00286-2