专家评论丨无细胞合成是更有效的高值产品合成手段，但规模化生产仍是待解难题

某些情况下，要想进行生物制造，生物活性并非必需品。与杀鸡取卵的故事大相径庭，“杀死”一个细胞之后，科学家反而得到了各式各样的生物产品。

1897 年，德国科学家 Eduard Buchner 通过使用切碎的酵母残渣和汁液进行糖的发酵，获得了诺贝尔奖，并以此击败了“活力论”观点——即生物体的活动有一些特殊之处，无法用生物学和物理学来解释。

大约 60 年后，合成生物学的兴起激起了无细胞科学的又一次发展。从基因表达到蛋白质合成，研究人员致力于将生物活动从活细胞中解放出来。

“在 1990 年代末到 2000 年代初，随着合成生物学领域的发展，有关无细胞系统的研究随之复兴。人们开始意识到这是制造、设计、功能测试和各种其他应用的绝佳方式，”英国伦敦帝国理工学院的合成生物学家 Paul Freemont 说，“未来使用无细胞系统作为抗体等高价值成分的制造平台具有巨大前景。”

现代的无细胞系统可用于帮助设计和制造新型蛋白质或新的代谢途径。借助该技术，昂贵的进口试剂可以使用便携式试剂代替，从而满足偏远或资源匮乏地区的需要。在此基础上，已有部分公司下场布局，且收获良多。

图丨部分无细胞合成公司融资情况（来源：CB Insights）

不过，无细胞合成的障碍仍然存在。“包括其制造工艺难以扩大规模，成本高昂等主要限制因素，因此该方法不会很快取代已有技术。”不过，上海科技大学李健教授介绍道，目前对于部分专业性强、稀缺的蛋白质资源，应用无细胞制造已经取得了阶段性成果，该技术正在帮助研究人员突破自然生产的限制。

正如 Buchner 在其 1907 年的诺贝尔获奖演说中所说的，想要研究“盒子”里面的内容，首先要做的事就是打开它。

“打开”活细胞以便获得更多产物

将活细胞打开（裂解）是制造无细胞系统最简单直接的途径。

一旦细胞的内容物溢出，通过离心去除幸存的未裂解细胞。留在溶液（裂解物）中的代谢酶与核糖体等粗混合物足以完成简单的蛋白质合成功能。

更加灵活的试验设计是无细胞合成的天然优势。

“与活细胞合成相比，将培养细胞，产物合成步骤分开进行避免了两者之间的资源竞争，提高反应效率；并且由于不需要维持活细胞的正常生理活动，反应条件也更加容易控制。”李健介绍，这就相当于把一个生物反应简化成一个化学反应。

以广谱抗生素缬氨霉素的生产为例，在传统的 TB 活细胞培养体系中，一旦培养基中的营养物质耗尽，大肠杆菌的生长就会逐渐停止，从而限制了缬氨霉素底物的供应。虽然分批培养的模式能够有效提高产量，但是比较来说，其产率远远低于无细胞系统。

图丨基于活细胞与无细胞系统的缬氨霉素生产水平比较（来源：Microorganisms）

将生产活动从活细胞中解放出来的显著优势在于，基于无细胞系统制造活细胞内难以表达的蛋白质将解决燃眉之急。

例如，约占所有人类蛋白质四分之一的膜蛋白几乎是一半药物的靶点，需求量十分广泛。但众所周知的是，该类蛋白的合成受到细胞毒性的限制，致使其天然来源供应不足。因此研究人员转而依靠大肠杆菌等细菌来表达足够数量的该类蛋白质。

基于无细胞系统的生产过程，即使细胞本身无法存活，打开细菌细胞也能让它们的基因表达机制发挥作用。通过添加必要的遗传指令，研究人员即可按需制造特定蛋白质。

2016 年，日本横滨 RIKEN 系统和结构生物学中心的生物学家使用无细胞大肠杆菌系统生产了19 种哺乳动物膜蛋白。他们发现由此产生的蛋白质通常比结合在完整细胞内时更容易获取和纯化。

除此之外，无细胞系统还能够用于制造更加复杂或表达外来的蛋白质，包括那些不存在于自然界中的蛋白质。

通过改造细胞，强制其在蛋白质翻译过程中转换氨基酸是手段之一。例如，刀豆氨酸被认为具有潜在的药物和医学特性。但作为非蛋白质形成氨基酸，天然蛋白质中并不存在刀豆氨酸，因此很难研究其生物学效应。

在活细胞培养中，作为精氨酸类似物，理论上使用刀豆氨酸替换蛋白质中的精氨酸属于常规操作。但由于刀豆氨酸对于许多动物细胞具有毒性，在活细胞培养物中制造携带刀豆氨酸蛋白质并不可行。

在2015年，德国的研究人员构建了基于大肠杆菌的无细胞系统，可以成功表达和收集大量绿色荧光蛋白，其中每个精氨酸分子都被刀豆氨酸分子取代。

图丨基于刀豆氨酸（品红色）取代的荧光蛋白结构（来源：Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters）

灵活、便捷的分散式制造平台

无细胞系统的另一个优势在于便携性。

细胞裂解操作简单，而且经过干燥的裂解液无需冷冻，更易保存。这将吸引那些地域偏远、难以获得进口试剂的研究人员。

2018 年，来自德克萨斯大学奥斯汀分校的研究人员表明，在实验室进行的部分化学反应中，完全可以使用裂解物代替昂贵的商业酶。他们使用工程化细菌进行蛋白质生产，然后通过简单地裂解步骤即可获得在聚合酶链式反应 (PCR) 中用于扩增 DNA 的酶。将裂解的细胞冻干处理后，可在室温下储存数月，复溶后继续使用。

为了证明该方法的可行性，他们通过快递将干燥的细胞裂解液发送给喀麦隆和加纳的合作人员，并成功应用于实验。

“我们将这项技术带到了真正可用的地方。实验室以外地区的人已经使用这项技术并且奏效了。” 不过，领导该研究的生物学家 Sanchita Bhadra 补充说，处理后的无细胞混合物的确切组分或存在批间差异，可能导致不同批次的性能存在差异。

尽管当前尚在试验阶段，但该技术提供了更加便捷的制造方式。Freemont 指出，“有了冻干的细胞裂解液和核酸模板，客户可以在世界上的任何地方制造产品。”他补充说，NASA 有一个关于无细胞系统的大型项目，正在探索用于航空领域的无细胞提取物。

据麻省理工学院合成生物学家 James Collins 介绍，迄今为止，该技术最有用的应用之一是制造坚固且便携的生物传感器。

2014 年，Collins 参与项目将基因开关整合到纸质无细胞传感器中，当其遇到埃博拉病毒的 DNA 时会改变颜色。一年半后，该小组开发了基于纸张的寨卡病毒诊断方法，并在多个国家/地区用于研究和检测。

在他的设想中，医生、士兵甚至宇航员可以携带无细胞颗粒作为一种方便的药物来源。“当你需要一种特定的药物或治疗分子时，只需将无细胞颗粒与核酸颗粒等一起加入水中，药物就会被生产出来，”Collins 说。

工业化难题：成本与规模化尚存壁垒

一个典型的无细胞蛋白质合成系统（也称为转录-翻译系统或TX-TL）不仅包括了细胞裂解液中残留的天然成分，还需添加反应混合液与核酸模板等调节基因表达反应的必须成分，包括酶辅因子、核苷酸、底物、氨基酸和 tRNA等。

原材料的高价意味着无细胞合成的价格会随着生产规模的扩大而上涨。

此前，来自伦敦帝国理工学院的化学工程师进行了一项经济评估，比较了使用基于中国仓鼠卵巢 (CHO) 细胞的传统细胞系和在 CHO 无细胞系统中制备单克隆抗体的相对成本效益。

评估结论是，假设其年产量为 200 公斤抗体，使用标准细胞系技术的生产成本约为每克蛋白质 85 美元。但当前的无细胞技术生产相同数量的产品，每克成本将是 2,700 美元，成本增至 30 倍以上。而对于小规模生产而言（25 公斤/年，用于早期分析），差异虽较小但依然显著：标准细胞系为 958 美元/克，无细胞系为 3,230 美元/克。

李健介绍，无细胞系统成本主要来自于内部能源、底物和氨基酸等消耗品，尽管当前阶段成本更高，但其产率、以及获得的产品质量也更加可观。因此，如何在产量与成本之间寻找平衡是各个公司考量的重点所在。

另一方面，如何扩大生产体系也是难题。不同于动辄上百升的活细胞培养发酵罐，当前试验阶段的无细胞反应体系普遍在毫升级别，扩大规模仍需摸索。

“很难立刻进入生产阶段，不过通过该方法快速有效地协助药物筛选也是发展方向之一。”李健表示，对于许多商业蛋白质来说，无细胞制造系统可能不会比现有方法更具成本优势，但对于部分专业性强且难制造的蛋白质而言，该方法具有竞争力。

目前，已有部分公司瞄准了无细胞系统商业领域。从国内市场来看，目前尚无成熟企业下场无细胞合成。不过已有部分公司正在跃跃欲试。

全球范围内，来自日本、美国的相关企业活动积极。例如位于加州的 Sutro Biopharma Inc. 正在基于无细胞蛋白质合成设施，专注于制造应用于制药行业的难制蛋白质。

（来源：Sutro Biopharma）

想要更广泛地实现无细胞系统制造，基础研究依然是发展重点。“对于该领域的研究远未成熟。”李健表示，特别是作为一个合成工具来讲，普适性、可操作性均需建立在更多的细胞工作研究基础之上。

其中一个问题在于，许多复杂的蛋白质在表达后需要由特定酶对其进行修饰。而目前为止，研究人员才刚刚开始了解蛋白质翻译后修饰是如何在活细胞中发生的。

活细胞花费了数百万年的时间进化出修饰所必需的成分，试图在一个精简的无细胞系统中进行同样复杂的操作显然困难得多。

Freemont 也特别强调了基础研究的必要性，了解活细胞工作的基本原理是推动无细胞系统工作的前提。他表示，尽管无细胞系统展现出了各种引人注目的应用前景，但我们仍处于探索一个广阔领域的开始阶段。

参考资料：

• https://www.pnas.org/content/118/46/e2117944118
• https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.abe9444
• https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0960894X15006381#f0015
• https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/bit.27541
• https://doi.org/10.3390/microorganisms9040780

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