专访梁兴国丨中国海大团队打破传统认知，使特定条件下任何序列DNA形成左手双螺旋，计划开发相关药物

众所周知，DNA 是双链结构，在不同的溶液的离子强度和湿度环境下，它有不同的类型，比如右旋的 A-DNA、B-DNA，左旋的 Z-DNA。

图丨不同类型的 DNA（来源：Molecular Biology）

此前，普遍认为只有 d (CG) n 嘌呤嘧啶交替（APP）的序列在高盐浓度、化学修饰或较强的负超螺旋等特殊条件下才会形成左螺旋 DNA（Z-DNA）。科学家们对于普通的 DNA 序列是否会形成 Z-DNA 有着各种猜测，但一直没有直接的技术手段进行研究。同时，大家对于在体内 APP 序列会形成 Z-DNA 的本质也缺乏足够的认识。

近日，中国海洋大学食品科学与工程学院梁兴国教授团队在核酸领域顶级刊物 Nucleic Acid Research 上发表了题为 “Nonalternating purine pyrimidine sequences can form stable left-handed DNA duplex by strong topological constraint” 的研究论文。

（来源：NAR）

借此，生辉 SynBio 邀请到梁兴国教授来与我们分享他的研究成果。

梁兴国 1992 年本科毕业于天津大学化工学院精细化工专业，1995 年获同专业硕士学位，毕业后留校任教，硕士及天津大学工作期间主要从事有机颜料及其分散剂的合成、纳米分散及喷墨打印机墨水的相关研究。

1999 年前往日本东京大学工学部化学生物系攻读博士，这虽然是梁兴国第一次接触生物化学，但他只用两年半就获得了博士学位。博士后期间开始协助导师小宫山真教授研究 DNA 化学剪切，不到半年多的时间里，就找到解决关键问题的突破口，即利用单链与双链 DNA 之间的差异实现 DNA 的特异性剪切。2003 年来到美国波士顿大学研究核酸检测。

2011 年回国，现为中国海洋大学食品与工程学院教授，主要研究方向为核酸化学，食品中核酸的定性定量检测及核酸在代谢过程中的营养作用等方面。

图丨梁兴国（来源：受访人提供）

从梁兴国的履历中可以看到其多次转变研究方向，并在每个方向上都取得了傲人的成绩。“时代的造就和自身对科研的热爱促使了我选择研究生物化学。” 梁兴国说道。

任何序列都会形成稳定 Z-DNA

有研究表明，Z-DNA 与基因表达调控、遗传不稳定性以及多种人类疾病有关，如 Z-DNA 形成序列有可能提高细胞系统中重组、缺失和易位事件的频率。

然而 Z-DNA 很容易转化为热力学有利的 B-DNA，一般条件下 B-DNA 较 Z-DNA 稳定，Z-DNA 只能在高盐浓度或某些特殊化学分子（如特定的手性分子或抗体）诱导等特殊条件下才可形成，因此在生理条件下极难获得稳定存在的 Z-DNA，这一问题使得目前对 Z-DNA 功能特性和作用机制的研究受到极大限制，大大制约了相关领域的发展。

事实上，早在上世纪 70 年代，以 Alexander Rich（麻省理工学院生物物理学家）为代表的科学家就发现并确认了 Z-DNA 的存在，但由于相关研究难以进行，使得科学界对 Z-DNA 的特性及功能缺乏足够的认识。

梁兴国自回国后就致力于制备稳定的 Z-DNA，近五年来，梁兴国团队在 DNA 和 RNA 环化以及构建生理条件下稳定的 Z-DNA 方面取得了重大突破。

2019 年，其团队就研究出可在正常生理条件下形成稳定 Z-DNA 的方法，只需将两个互补的无需化学修饰的单链 DNA 小环混合杂交就会自发诱导拓扑限制，将一半的双链 DNA 缠绕成稳定的 Z-DNA。正如两个环形的皮筋互相缠绕时，左螺旋和右螺旋一定会同时形成。研究显示，如采用此方法，即使目前认为不可能形成 Z-DNA 的随机序列也会形成 Z-DNA 。该成果于 2019 年 3 月发表在 JACS 上。

此次在 NAR 发表的文章更是打破了 “只有 APP 序列可以在强拓扑限制下形成 Z-DNA” 的传统认知，通过各种生物化学方法分析发现，在拓扑限制下普通的序列会形成同 APP 序列这种特殊序列同样稳定的 Z-DNA。

梁兴国说道，“相对于单链状态而言，互补的 DNA 序列可以形成自由能大大降低的 Z-DNA 和 B-DNA 两种状态，而两种状态之间自由能相差很小。”

他补充道，“在体内 APP 序列会优先形成 Z-DNA 的原因是，APP 序列的左螺旋和右螺旋两种状态的自由能相较于非 APP 序列更为接近，就像水总倾向于向低处流一样，分子也总是倾向于以自由能更低的状态存在。在无 APP 序列的区域，非 APP 序列就会首当其冲，在适当的拓扑限制下形成相对稳定的 Z-DNA 结构。”

图丨拓扑限制法制备 Z-DNA 示意图及相同序列的线性 ssDNA、Z-DNA 和 B-DNA 自由能水平的比较  （来源：研究论文）

计划开发 Z-DNA 相关药物

“从药物开发角度，不再局限于 “CGCGCG” 这样的特殊序列，可以根据需要采用相应的序列进行。目前红斑狼疮等一些疾病与 Z-DNA 或 Z-DNA 抗体有关，对 Z-DNA 的深入理解对于理解疾病作用机理以及开发相关药物有重大意义。” 梁兴国表示。

原有的形成 Z-DNA 的方法是利用几千碱基对的质粒 DNA，这种方法难以自由改变序列，也很难鉴定是哪里形成了 Z-DNA。“目前只有我们的方法可以做到，而且简便易行。”

形成 Z-DNA 一方面可以为研究提供原材料，目前梁兴国团队已和三个国际研究团队建立合作，另一方面也可开发药物用于治疗同 Z-DNA 形成相关的疾病。

他也透露，下一步计划是继续进行基础研究，积累对于 Z-DNA 的新认识，同时制备各种序列的稳定 Z-DNA，合作开发相关药物。

“研发环状 RNA 产品具有光明前景”

“最早（2006 年开始）就是为了人工制备稳定的 Z-DNA 而将 DNA 环化，因难以解决多聚副产物的问题，直到 2017 年才因安然博士的出色工作取得初步成功。后来发展到 RNA 环化，环化后两个互补的单链环杂交才能形成 LR-Chimera 或叫 Z-B-Chimera，将来计划制备稳定含有 RNA 的 LR-chimera。”

可以说制备稳定 Z-DNA 的基础是将 DNA 环化，而环化技术目前广受大家期待。梁兴国说道，“环化 DNA 或 RNA 的优势在于半衰期较长，由于处于闭环，避免了核酸外切酶对其切割，因此在体内发挥的效率较长。本来我们是为了获得 LR-chimera 开始研究单链核酸的环化，无意中发展了单链核酸环化技术，由此带来了环化单链核酸的各种应用，特别是单链 RNA 的环化技术。”

1976 年，德国科学家证实类病毒是一种单链共价闭合环状 RNA 分子，这是人类首次发现环状 RNA 分子的存在，但在当时背景下，科学家们只将其看作不寻常剪接的副产品。随着高通量 RNA 测序（RNA-seq）和环状 RNA 特异性计算生物学领域的快速发展，真核生物中出现大量环状 RNA，人类开始对其功能进行探索。

图丨环状 RNA 的功能及应用（来源：BMC）

与线状 mRNA 相比，环状 RNA 的结构让它们能够避免核酸外切酶识别，具有更高的稳定性。基于以上特点，环状 RNA 将在改善生产过程复杂性、热稳定性、提高 RNA 疗法递送效率等方面具有一定优势，或将为临床未成药靶点提供新的解决方案。

不过目前几乎所有的 RNA 药物的主要问题是在体内存在时间比较短，应用于癌症和罕见病症的病人尚可，但对于一般的疾病，它的安全性和效率都要达到很高的水平。

他说道，“体内主要是核酸外切酶从末端消化 RNA，但环状 RNA 也会有一定程度的破坏，环状 RNA 药物药效的发挥也需要足够高的浓度，无疑，环状 RNA 因优势明显而具有光明的研发前景，虽然有很多困难需要克服，但 mRNA 疫苗及相关药物的出现很好地证明了其可行性。”

他补充道，“在产业转化上，精准快速的环状 RNA 制备以及规模化量产仍然是难题，但这是药物研发公司正在做或希望有人能做好的事情。”

梁兴国团队目前也在积极地解决这一问题，目前该团队已成功构建了一种 RNA 的高效环化方法，可达到少量生产环状 RNA，他表示，若要实现大规模生产，迫切需建立先进的整个环状 RNA 生产线。

“2021 年 9 月，我们新获批了一项发明专利《一种 RNA 的环化技术》，并刚刚同广州吉赛生物签订了技术转让合同。我们的技术关键在于重新设计线状 RNA 序列，使其更容易环化。” 他还补充道：“虽然通过内含子自剪切方法也可制备环状 RNA，但会额外引入病毒元件，这些病毒元件序列会对生物体具有较大的免疫原性。相比于国外用内含子自剪切的专利技术，我们的技术具有更低的免疫原性，即不易引起机体免疫反应。我们针对连接成环的 RNA 序列，通过重新设计环化位点，可直接将线性 RNA 环化，无需借助外加的辅助链，降低了后续纯化工艺的难度，且大分子副产物显著减少。我们希望能为环状 RNA 的应用开发提供高质量的原料，使我国在这一领域能领先世界。”

参考资料：

• https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/17485386/

• https://www.scimall.org.cn/article/detail?id=483505

• http://html.rhhz.net/SWJSTB/html/2018-12-21.htm

• http://news.bioon.com/article/6791205.html

• https://academic.oup.com/nar/advance-article/doi/10.1093/nar/gkab1283/6489951

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