【Nature重磅】想瘦吗？瘦素作用于大脑的最新证据

本文主要介绍了减肥的关键----瘦素。

20多年前，诺奖潜力股“瘦素”的发现改变了肥胖研究，然而，瘦素的作用机制至今仍是一个谜。瘦素（Leptin），是一种由白色脂肪组织分泌的蛋白质类激素，可作用于大脑以调节糖、脂肪的能量代谢过程，抑制食欲，促进能量消耗，维持血糖稳态。瘦素或其受体（LEPR）功能紊乱会导致肥胖症或糖尿病。

过去，人们发现长期节食会导致瘦素分泌水平逐渐下降，饥饿相关激素上升，机体会时常感到饥饿。而且，低瘦素水平会降低能量代谢率，消耗水平越来越低。这便解释了节食减肥的“易反弹”现象。

那么，瘦素如何作用于大脑呢？

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长期以来，科学家们一直在寻找瘦素的脑内靶点。早期研究瘦素的工作者曾经提出，瘦素主要作用于下丘脑弓状核（Arcuate nucleus, ARC）的刺鼠相关肽（AgRP）神经元以及阿黑皮素原（POMC）神经元。但这些研究使用Cre-loxp系统选择性敲除AgRP或POMC神经元中的瘦素受体（LEPR），并未重复出LEPR缺陷鼠（Leprdb/db）的肥胖症、糖尿病现象[1-3]，表明机体内瘦素的作用并不一定需要AgRP或POMC神经元，因此关于瘦素作用与ARC的推论成了悬案。

下丘脑弓状核的位置

然而，事实果真如此吗？

2018年4月26日，《Nature》杂志刊登了美国塔夫茨大学医学院孔栋教授的最新重要工作[4]，他们使用CRISPR-Cas9基因编辑技术特异性敲除成年小鼠的AgRP神经元的LEPR，首次观察到，AgRP神经元LEPR敲除后，小鼠展现出与Lepr^db/db相似的肥胖症、糖尿病现象，颠覆了瘦素相关神经机制的主流观点。

 孔栋教授

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结果

AgRP神经元活性过高诱发小鼠食欲过盛和高血糖现象

过去的研究证实，链脲霉素（STZ）可特异性杀死胰岛β细胞，导致胰岛素分泌量严重降低，血糖水平升高，进而诱导糖尿病小鼠模型。此模型鼠的的继发性症状是瘦素分泌水平严重降低，但是由于缺乏胰岛素，小鼠并不肥胖。因此STZ处理的小鼠可用于研究瘦素的神经机制。

首先，作者通过FOS表达水平来鉴定STZ处理后小鼠被激活或抑制的脑区，发现下丘脑各核团ARC、DMH、LH均被高度激活，而腹腔注射瘦素3小时后，只有ARC活性降低回生理水平（图1a-b）。此外，ARC中被STZ激活的神经元绝大多数为AgRP/NPY神经元（ARC中NPY神经元和AgRP神经元共标），这些神经元的发放频率也显著升高（图1c-e）。

为研究AgRP神经元是否参与STZ处理后小鼠的病理状态，作者在AgRP-Cre小鼠双侧ARC中注射AAV-DIO-hM4Di并进行STZ处理，加入CNO抑制AgRP神经元后，发现AgRP神经元FOS表达水平显著下降，小鼠进食量以及血糖均恢复至生理水平（图1f-k）。

这些结果表明STZ病理模型小鼠中，ARC脑区AgRP神经元的活性是必要的。 

图1 AgRP神经元活性过高诱发小鼠食欲过盛和高血糖现象

2.CRISPR介导敲除AgRP神经元中LEPR诱发肥胖症和糖尿病

前文结果表明瘦素作用于下丘脑弓状核（图1a-b），这与过去的研究结果产生冲突[2]。为证实此瘦素功能靶点，作者在AgRP-Cre::LSL-Cas9-GFP小鼠双侧ARC中注射AAV-sgLepr，通过CRISPR-Cas9系统特异性敲除AgRP神经元中的LEPR，排除了传统基因敲除带来的代偿副作用。他们发现，CRISPR介导敲除LEPR后，LEPR活性分子标记pSTAT表达量显著下降，小鼠产生肥胖症和糖尿病现象，具体表现在体重严重上升、进食量加大、代谢率降低、血糖升高等方面（图2a-l），其体重接近于LEPR缺陷鼠Lepr^db/db（图2k）。

接下来，作者希望了解LEPR是否参与STZ诱导糖尿病模型，他们在STZ处理后小鼠的侧脑室中泵入瘦素，发现CRISPR介导敲除LEPR后，瘦素不再缓解高血糖症状，表明了ARC脑区AgRP神经元中LEPR的必要性（图2n-o）。

此外，作者也通过CRISPR-Cas9系统特异性敲除POMC神经元中的LEPR，并未诱发小鼠肥胖症和糖尿病，表明瘦素的作用靶点是ARC中AgRP神经元。 

图2 AgRP神经元中敲除LEPR诱发肥胖症和糖尿病

3.瘦素调节体重和血糖水平需要AgRP神经元K_ATP通道

那么，瘦素如何抑制AgRP神经元呢（图1a-e）？过去的研究指出，瘦素通过KATP通道超极化下丘脑神经元，但是其亚基Kir6.2的全身敲除仅引起血糖略微升高，并未诱发肥胖症[5]。

为探究AgRP神经元中K_ATP通道的功能，作者继续应用CRISPR-Cas9系统，在AgRP-Cre::LSL-Cas9-GFP小鼠单侧ARC中注射AAV-sgK_ATP，发现CRISPR介导敲除亚基Kir6.2后，AgRP神经元的FOS表达量、静息膜电位、发放频率均显著提高，且不受K_ATP阻断剂影响（图3a-d）。

病理学方面，在AgRP-Cre::LSL-Cas9-GFP小鼠双侧ARC中注射AAV-sgK_ATP，可诱发小鼠肥胖症、糖尿病现象，同样表现在体重严重上升、进食量加大、代谢率降低、血糖升高等方面（图3e-n），连续3天注射瘦素也无法缓解这些症状（图3o-p）。表明AgRP神经元K_ATP通道参与瘦素调节体重和血糖的过程。 

图3 瘦素调节体重和血糖水平需要AgRP神经元KATP通道

4.AgRP神经元的抑制性输入参与瘦素抑制进食过程

前文作者通过CRISPR-Cas9系统敲除AgRP神经元K_ATP通道后，诱发小鼠高血糖、糖尿病多种症状，但是并不影响瘦素诱导的急性现象——即瘦素对饥饿处理后小鼠过度饮食的抑制作用。那么，此抑制作用的神经机制是什么呢？

作者想到了GABAA受体介导的抑制性输入，于是展开研究。首先，他们电生理记录饥饿处理后小鼠的AgRP神经元，发现其接受的抑制性突触后电流（sIPSC）频率很低。但是加入瘦素后，sIPSC频率显著升高（图4a）。然后，他们在AgRP-Cre::LSL-Cas9-GFP小鼠单侧ARC中注射sgGabr1/2/3以敲除AgRP神经元GABA_A受体，发现AgRP神经元不再接受sIPSC，瘦素不再抑制饥饿处理后小鼠的过度进食现象（图4b-d）。

接下来，作者研究瘦素在AgRP神经元GABA输入过程中的作用。饥饿处理小鼠后，作者记录AgRP神经元，通过电刺激诱发IPSC。加入瘦素后，双脉冲比值显著降低（图4e），表示突触前的作用机制。作者又在Vgat-cre::Npy-hrGFP小鼠的VMH中注射AAV-DIO-hM4Di，通过CNO抑制VMH中GABA能神经元，发现AgRP神经元接受的sIPSC频率大幅降低（图4f）。

最后，作者在Vgat-Cre小鼠的VMH中注射AAV-sgLepr和AAV-DIO-Cas9以敲除VMH脑区GABA神经元中LEPR，发现瘦素不再抑制饥饿小鼠的过度饮食现象（图4k），表明瘦素诱导的急性现象主要作用于VMH中GABA能神经元，即AgRP神经元的抑制性输入。 

图4 AgRP神经元的突触前GABA输入参与瘦素抑制进食过程

封面图片来源于网络

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