近几年来，脑类器官（Brain organoids）的培养和研究一直是神经科学领域的一大热点，这项由胚胎干细胞（Human embryonic stem cell, hESCs）技术而发展起来的脑科学技术一经发表就吸引了无数实验室的目光。
要知道，无论是对于研究发育还是研究功能的脑科学实验室来说，多一份人脑组织样本往往就意味着文章能够提升一到两个档次，其意义自然不言而喻。 但如何获得人脑组织样品一直都是一个令大家十分头疼的大问题，一是因为器官伦理方面的问题，二则是人脑组织样品大多是经由家属同意后，医院在捐赠者死后获取的，这使得样品的质量往往大打折扣。
图1：免疫荧光下的脑类器官组织切片
脑类器官培养技术的出现，给人脑组织样品难获取这一问题提供了一个十分光明的解决路径，特别是对于研究大脑发育的科学家来说，这简直就是一项专门为他们而开发的实验技术！
图2：培养皿中的脑类器官
虽然脑类器官培养技术的前景是十分光明的，但是目前这一技术还有很大的局限性。经由人干细胞诱导分化的脑类器官能够在早期形成简单的分层结构，但却无法像正常人脑一样继续分化发育下去形成更复杂的多层细胞结构，其大小也一般仅有5mm-1cm左右，与正常大脑相差甚大。并且，脑类器官也极少生成小胶质细胞，而小胶质细胞对于神经元的成熟和突触的形成来说是必不可缺的一类细胞，其在大脑的发育成熟过程中扮演了极其重要的作用，这也使得目前的脑类器官分化还不够成熟。
另外，还有十分重要的一点，目前培养的脑类器官中几乎不出现功能性的血管网络，这使得培养到后期的脑类器官内部细胞无法获取到足够的养分和氧气，导致脑类器官从内部细胞开始凋亡坏死，极大影响了培养进程及可培养时间。可以说，微血管网络形成的问题成为了目前制约脑类器官培养技术发展的重大瓶颈之一。图3：本文发表由耶鲁大学In-Hyun Park团队发表于nature methods
面对这一难题，来自耶鲁大学In-Hyun Park的实验团队找到了突破的办法，通过在培养的人皮层脑类器官（Human cortical organoids, hCOs）中异位表达ETV2转录因子，成功使其出现了复杂的功能性血管网络，这不仅使得具血管人皮层脑类器官（vascularized hCOs, vhCOs）出现了更复杂的分化结构，神经元细胞更加成熟，而且还首次在其中发现了血脑屏障（blood-brain barrier, BBB）类似结构！
为了形成具血管人皮层脑类器官（vascularized hCOs, vhCOs），研究者首先发现，与为人血管内皮细胞形成高度相关的ETV2转录因子，将其过表达在已分化的神经细胞环境中，能够将人胚胎干细胞（human embryonic stem cells, hESCs）诱导分化为内皮细胞（endothelial cells, ECs）。利用这一特点，在由人胚胎干细胞诱导形成的人皮层脑类器官（hCOs）中，研究者通过在培养第18天时向部分细胞（~20%）过表达ETV2，成功形成了内皮细胞Marker阳性的微血管类似结构。
图4：EVT2诱导hCOs后产生具有功能性微血管结构的vhCOs
为了检测这些微血管类似结构是否具有功能性，研究者又分别在培养第30、70天时，对control hCOs和vhCOs分别检测了新生血管Marker CD31的表达情况，结果表明vhCOs在30天已经有约10%区域CD31显示阳性，70天时阳性区域达到约40%，而control hCOs即使培养至70天也没有检测到CD31阳性(图4,a-b)。FITC浸染实验也表明，血管内皮细胞Marker CD31与CDH5阳性细胞区域能够使得外界环境中的FITC进入到类器官内部，进一步说明了新生微血管类似结构的功能性(图4,c)。
图5：vhCOs相比传统hCOs能够产生更多神经细胞
得益于为微血管结构的形成，脑类器官内部细胞能够获得更多的氧气及养分，vhCOs在培养第30天时组织直径显著大于control hCOs，且在第70天及第120天时，vhCOs细胞的HIF-1α（没错，就是前几天那个获得诺奖的明星分子！）表达量和细胞细胞死亡率均极显著低于control hCOs(图5，e-f)。值得注意的是，在第80天时，vhCOs中8/20（8 of 20）的细胞能够产生动作电位，而control hCOs中仅有1/20 (图5，g-h)。这也就意味着，vhCOs中的神经细胞不仅存活率要较control hCOs更高，而且具有功能的神经细胞数量也要比control hCOs中更多！
图6：vhCOs及hCOs单细胞转录组测序分析
研究者还对培养至第70天时的vhCOs及control hCOs分别进行了单细胞转录组测序，结果表明在vhCOs中大量血管生成因子、周皮细胞Marker、胶原基因以及细胞粘附相关基因出现高表达，而在control hCOs则缺少这些基因的表达(图6，a-f)。
更为关键的是，转录组数据还表明vhCOs中的神经细胞在同一时间点总是要比control hCOs中的细胞更加成熟(图6，g-h)。这一数据充分说明了ETV2的过表达，使得vhCOs中的部分细胞被诱导向血管内皮相关细胞类型方向进行分化。
图7：vhCOs相较hCOs高表达紧密连接及胶质细胞Marker
更为神奇的是，在vhCOs中部分特殊的内皮细胞还形成了神经周血管丛，并且还与脑内的神经血管紧密相连（tight junction），其性质十分类似于血脑屏障结构。在培养至70天时的vhCOs脑室腔结构中，发现了α-ZOD1，occlundin（OCLN），KDR出现高表达（紧密连接Marker）(图6，a-b,d)。并且，在vhCOs中还发现了GFAP及S100β的表达，表明了胶质细胞的存在(图6，c)。而在功能方面，通过跨内皮阻抗（trans-endothelial electrical resistance, TEER）分析表明，第30天及第70天时的vhCOs的TEER均显著性高于control hCOs，且其在三维结构上TEER阻值十分接近于人血脑屏障TEER阻值(图6，e-f)。这些证据均说明ETV2诱导形成的vhCOs中的出现了与人血脑屏障十分类似的结构。
图8： vhCOs具有高TEER性质且对β1-42-oligo敏感
特别地，研究团队还将vhCOs作为模型研究了Aβ1-42-oligo及Aβ1-42-fibril对于脑类器官的影响，结果表明添加Aβ1-42-oligo后FITC浸染阻值面积出现减少，且α-ZO1通路也出现下调，而添加了Aβ1-42-fibril的实验组则未出现这一现象(图8，g)。该结果与之前Aβ1-42的累积会损害紧密连接并损伤血脑屏障的前期研究结果十分类似，初步阐明了将vhCOs作为未来AD研究新模型的可行性。
图9：vhCOs在体内培养依然具有功能性微血管结构
为更进一步探究vhCOs新生微血管组织的功能性，研究团队将培养的vhCOs与control hCOs分别移植进入了同一只小鼠的左右大腿肌肉中，在移植后第10天和第30天进行MRI检测及FITC及hCD31注射实验，结果表明移植后的vhCOs在小鼠肌肉中存活得十分不错，MRI在第10天及第30天均能观察到其组织结构，而相对的，control hCOs则无法用MRI检测到(图9，a-c)。FITC级hCD31注射结果更进一步表明了，仅有vhCOs在移植后出现了功能性的微血管网络(图9，d-e)。In-Hyun Park团队在这一篇文章利用ETV2这一转录因子，首次成功在脑类器官中形成了微血管网络及类血脑屏障结构，这极大提升了脑类器官的培养成熟度及分化程度，同时也解决了该领域的一个老大难问题，相信未来脑类器官的培养技术很快就将会有惊人的发展！参考文献：
1. Cakir B, Xiang Y, Tanaka Y, et al. Engineering of human brain organoids with a functional vascular-like system[J]. Nature Methods, 2019: 1-7.2. Cerebral organoids recapitulate epigenomic signatures of human fetal brain. Chongyuan Luo, Madeline A. Lancaster, Rosa Castanon, Joseph R. Nery, Juergen A. Knoblich, and Joseph R. Ecker. Cell Reportsdoi.org/10.1016/j.celrep.2016.12.0013. Trujillo C A, Gao R, Negraes P D, et al. Complex Oscillatory Waves Emerging from Cortical Organoids Model Early Human Brain Network Development[J]. Cell stem cell, 2019.作者信息
编译作者：Kagami（brainnews创作团队）
校审：Simon（brainnews编辑部）