厉害！国产成像利器再次助力一篇Neuron文章，重温这个给大脑“拍照”的设备的科研成绩
下丘脑存在着一群特殊的神经内分泌细胞，它们既保留了神经元的放电特性，又能够释放激素入血，作用于外周的靶器官，在调节机体生长发育、代谢生殖和内环境稳态中发挥着重要作用。其中，分泌血管加压素（AVP，又称抗利尿激素，ADH）和催产素（OXT）的神经元主要位于下丘脑室旁核（PVN）与视上核（SON），它们胞体大，轴突长且直接投射至神经垂体，构成下丘脑-神经垂体系统（Hypothalamo-Neurohypophysial System, HNS），即大细胞性神经内分泌系统（Magnocellular Neuroendocrine System, MNS） （图1）。从神经垂体释放入血的AVP与OXT调控机体的水盐平衡、分娩与泌乳等重要过程，近年来药理学研究显示AVP和OXT作为神经肽类神经调质，在脑内能调控机体的社交、恐惧和情感等，但内源性OXT是通过释放至外周后重新入脑，还是大细胞内分泌神经元（MNCs）直接在脑内释放OXT发挥作用目前并不清楚。阐明内源性OXT的作用及机制依赖于对MNCs全脑投射的精细三维重构及其功能活动的精准靶向操控。
图1.下丘脑大细胞性神经内分泌细胞的轴突直接延伸至垂体后叶，即神经垂体，构成下丘脑-神经垂体系统（HNS）。
（图自https://commons.wikimedia.org/）
带着这些问题，浙江大学脑科学与脑医学学院段树民院士和高志华教授的团队巧妙地将逆向示踪病毒注射至大鼠的神经垂体，利用病毒沿轴突高效逆向转运的特性，点亮整个HNS。团队继而与华中科技大学武汉光电国家研究中心龚辉教授团队合作，利用自主开发的荧光显微光学切片断层成像（fMOST）技术，对大鼠全脑进行成像并首次完成了HNS高分辨率的三维重构（图2）。研究发现除了经典的PVN与SON外，下丘脑内多个核团都存在向神经垂体投射的AVP和OXT神经元，且部分OXT阳性大细胞能发出轴突侧枝（collaterals）投射至皮层、杏仁核、伏隔核、纹状体等下丘脑外的区域，提示他们可能同时向外周和中枢内释放OXT（图2）。
图2. 左，下丘脑-神经垂体系统的三维重构展示；右，大细胞内分泌神经元侧支投射示意图。
为进一步探究OXT大细胞的功能，研究人员构建了OXT-Cre转基因大鼠（在OXT阳性细胞中表达Cre重组酶），并在其神经垂体注射了Cre依赖、逆向转运的化学遗传学病毒，利用药物诱导，特异性操控OXT大细胞。研究发现激活OXT大细胞不仅能通过投射至神经垂体的主轴突释放OXT，提高外周血液中OXT的含量，也能通过脑内的侧枝释放OXT，促进大鼠的社交行为；而抑制这些细胞则产生了相反的效果。提示OXT大细胞能在外周和中枢释放OXT，协调机体稳态和中枢行为（图3）。上述研究结果于2020年11月19日在线发表于Neuron杂志（https://doi.org/10.1016/j.neuron.2020.10.032）。
图3. 图文摘要：通过fMOST技术重构大鼠下丘脑-神经垂体系统；利用化学遗传学方法特异操控OXT大细胞能影响外周血OXT水平，并调控大鼠的社交行为等。
浙江大学脑科学与脑医学学院高志华教授和华中科技大学武汉光电国家研究中心李安安教授为本文的共同通讯，浙江大学博士后张斌和博士研究生邱礼耀是论文共同第一作者，博士研究生肖薇参与了部分实验，并参与设计了文章的图文摘要。研究受国家重点研发项目，国家自然科学基金，广东省科技计划项目，中央高校基本科研业务费和中国博士后科学基金等资助。
近几年，利用荧光显微光学切片断层成像（fMOST）技术已经发表了多篇高水平的文章，下面brainnews编辑部对部分研究进行简单汇总，一起学习。
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01
2019年7月8日，华中科技大学武汉光电国家研究中心骆清铭教授团队在《自然神经科学》（Nature Neuroscience）学术期刊上发表了题为“A whole-brain map of long-range inputs to GABAergic interneurons in the mouse medial prefrontal cortex”的文章，详细描绘了小鼠内侧前额叶皮层γ-氨基丁酸（GABA）能神经元长程输入环路的全脑图谱。
骆清铭教授团队利用自主研发的荧光显微光学切片断层成像技术（fluorescent micro-optical sectioning tomography, fMOST），结合神经示踪术，详尽解析了小鼠脑内侧前额叶的两个亚区内三种亚型GABA能神经元的上游长程输入环路。研究发现，三种GABA能神经元接受相同脑区的输入，但不同脑区输入的比例不同。用免疫组化方法证实了内侧前额叶皮层的输入是有多种神经递质的调控，包括基底前脑的PV阳性长程投射神经元、胆碱能神经元和来自中缝核的五羟色胺神经元。结合电生理记录，进一步发现输入到内侧前额叶GABA能神经元的基底前脑胆碱能神经元和中缝核的五羟色胺神经元均可共释放谷氨酸。
借助于高分辨率成像获得的全脑数据集，研究人员重建出了119个输入神经元的三维形态结构。图像显示，基底前脑的输入神经元可同时调控内侧前额叶及丘脑核团，而后者也可投射到内侧前额叶，形成基底前脑-前额叶皮层-丘脑的神经环路；并发现存在内侧前额叶-纹状体-前侧丘脑-内侧前额叶的新环路。该研究为理解基底前脑和丘脑如何调控皮层和皮层下的神经活动提供了新的模型。进而，通过重建皮层和海马输入神经元的精细形态，发现投射到内侧前额叶皮层的新型神经元不同亚型的GABA能神经元表现出了不同的输入模式，这些不同的平行环路可能执行不同的功能。这些研究将为神经元分类和内侧前额叶皮层的功能提供新的参考。
图1 使用fMOST技术结合RV病毒逆行示踪法，解析内侧前额叶不同GABA能神经元的输入神经元的全脑分布、上游输入神经元新类型和新环路。A. 研究流程示意图。B. 内侧前额叶两个亚区内的三种GABA能神经元长程输入神经元，在小鼠全脑内的三维分布图。C. 三维重建的皮层输入神经元和形态模式分类结果。D. 三维重建的海马输入神经元。E. 内侧前额叶与无名核以及前侧丘脑构成的新环路模式图。
02
全脑血管网络的构筑尤其是微循环系统的高精度解析是获得这项研究成果的前提条件。在此之前，实现全脑尺度高分辨率成像、低信噪比影像数据增强、高空间复杂度三维图像数据的可视化和量化分析等方面依然面临诸多挑战。在该项工作中，研究团队应用华中科技大学骆清铭教授团队发展的原创MOST技术，首次在0.35 × 0.35 × 1.00微米分辨率水平上获取了APP/PS1转基因AD模型小鼠（Tg-AD）的全脑数据集，再应用团队自己发展的算法对预处理后图像进行优化，构建了包含从直径几十微米的大血管到小于2微米的毛细血管的完整小鼠全脑跨尺度3D血管图谱（图1）。
图1. 正常C57BL/6小鼠全脑及海马血管分布。（A）正常C57BL/6小鼠全脑血管可视化；（B）经海马冠状面血管网络的最大值投影（用颜色表示血管体积密度）；（C）右侧海马血管构筑显示等间距的海马血管呈耙式分布；（D）垂直于海马纵轴的截面显示海马横行血管的走势。
03
2020年8月8日，湘潭大学化学学院曹毅博士课题组在Science of the Total Environment （影响因子6.551），利用fMOST技术实现了对一种新型人3D类脑中的特定蛋白空间分布的成像。
研究人员使用了一种新型人3D类脑模型，分析了多壁碳纳米管对人脑一氧化氮信号通路的影响。通过传统的毒理学分析手段，例如一氧化氮染色，自由基染色以及Western blot等技术，研究人员证实了高浓度的多壁碳纳米管（64 mg/mL）会导致类脑一氧化氮的产生的不足，神经系统一氧化氮产生蛋白nNOS下调。这证实了类脑模型可以应用于环境毒理学的研究工作。但传统毒理学分析手段并没有提供空间分布信息，无法确定类脑对多壁碳纳米管暴露最敏感的部位。
与fMOST技术相结合，研究人员得以分析多壁碳纳米管暴露以后nNOS在全类脑的分布。结果表明，虽然多壁碳纳米管仅仅直接接触类脑的外层，但nNOS的荧光信号不仅仅在类脑的外层有明显的下调，在里层也有明显的下调，这可能是因为一氧化氮是一种小分子的信号分子，其信号可以实现在类脑不同神经皮层的传递。与传统的毒理学分析技术相结合，fMOST可以用于进一步确认环境污染物的刺激对人神经系统的影响，并提供传统的分析技术所无法提供的信息。
图1.利用fMOST技术在全类脑范围内3D重构了nNOS蛋白的分布。A为control组，B为64 mg/mL多壁碳纳米管暴露组。
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2018年11月20日，北京生命科学研究所罗敏敏与华中科技大学龚辉等人在Nature Methods上在线发表了题为Cell-type-specific and projection-specific brain-wide reconstruction of single neurons的文章。研究人员们开发了一种双腺相关病毒表达系统，可以对细胞类型和投射特异性的单个神经元进行强大而准确的标记。
研究证明了其用于中脑多巴胺神经元和纹状体突出的皮质神经元的全脑重建的效用。研究人员进一步扩展了标记方法，结合fMOST荧光显微光学切片断层成像技术对单个神经元的类型特异性进行重建。该实验提供的工具扩展了在单神经元水平维度来解析脑结构的能力，有助于对脑疾病下单神经元投射的异常提供有效的解决手段。
基于fMOST技术的大脑中9种皮层纹状体神经元重建
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