Nat Chem Biol：新型光遗传学工具cpLOV2助力远程基因工程控制

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（荷花代表cpLOV2在光遗传学中的应用）

LOV2是一种非视蛋白型的植物来源的光遗传学工具。通过将具有不同生理功能的蛋白质效应子（Effector）连接到LOV2蛋白的C端，利用黑暗条件下与LOV2分子间的空间位阻效应，可以抑制效应子的功能；而在光照条件下，LOV2的C端Jα发生解旋和分离，从而使效应子的功能得到恢复。

基于此，研究者可以通过LOV2实现远程时空分辨率地调控目的效应子活性及其相应生理学进程。然而，LOV2倾向于将效应子融合到具有光控能力的C端Jα螺旋下游，而许多效应蛋白的N端需要足够的自由度才能够正常发挥功能。因此，基于传统LOV2体系的应用受到了严重的限制。

2021年5月6日，Texas A&M University的周育斌教授课题组，中科院合肥物质科学研究院的王俊峰研究员课题组，University of Massachusetts Medical School的韩纲教授课题组以及Texas A&M University的黄韵教授课题组合作（文章的共同第一作者为何涟博士，朱磊博士，谭鹏博士以及黄凯）在Nature Chemical Biology上发表了题为Circularly permuted LOV2 as a modular photoswitch for optogenetic engineering 的文章。

该研究对LOV2进行了优化循环排列（circular permutation）设计，获得了能将效应子融合到蛋白N端，并提供不同锁定界面的新型光遗传学工具cpLOV2。cpLOV2不仅能够为原已在LOV2体系中实现的技术提供了新的构建方式，例如钙离子通道的远程开启，CRISPR–Cas9介导的基因编辑控制，基因转录的光控重编程等，还创新性地开发了LOV2体系无法实现的光遗传学应用，例如基于MLKL的癌细胞自杀的激活等。特别是基于cpLOV2实现的，可以精准地调控对肿瘤细胞体内杀伤的光控嵌合抗原受体T细胞（optoCAR T）免疫疗法，获得了显著效果。

图：cpLOV2改造设计及其光遗传学应用拓展

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首先，基于对结构的分析，研究者通过循环排列的方法构建了cpLOV2，在保持感光核心PAS结构域不变前提下将Jα螺旋转移到了蛋白的N端，使得效应子可以通过C端与Jα螺旋融合，从而拓展了光控体系的可用构建方式。

在体外实验中，研究团队利用液体核磁共振等技术证明了cpLOV2具有与LOV2相似的整体结构，和光激发后Jα螺旋解旋并释放的能力，并在LOVTRAP和iLID两种光控蛋白二聚体系中实现了无缝转化。

cpLOV2为光遗传学应用的开发提供了更多可能性。例如在STIM1介导的光控ORAI钙离子通道开放的应用中，研究者尝试了多种不同的基于LOV2和cpLOV2构建方式，结合STIM1效应子SOAR、自抑制区域CC1等不同序列，新发现了几种仅在cpLOV2构建方式下可以实现较强的光控通道激活效应的组合，从而证明了cpLOV2与效应子的作用界面和方式与LOV2有显著的区别。cpLOV2对于需要自由N端的效应子，例如细胞程序性坏死（Necroptosis）的关键因子MLKL，cpLOV2-MLKL有效地实现了光控的细胞死亡（LOV2-MLKL无法实现）。

为了进一步探索cpLOV2的应用可能，研究者设计了基于cpLOV2的光控蛋白二聚体系（cpLID），并在多种光遗传学工具中使用。许多细胞事件的发生需要亚细胞定位的过程，cpLID的一个组分sspB可以融合不同膜定位序列，另一组分ssrA-cpLOV2就可以为相应的胞质蛋白提供亚细胞定位和活动的精准控制。

在细胞基因操作方面，在CRISRP/Cas9系统的抑制子AcrIIA4中引入了cpLID作为光控元件后，构建的LiCaSiNO实现了对基因编辑和基因表达的高时空分辨率精准控制。

嵌合抗原受体T细胞（CAR T）免疫疗法是一种治疗癌症的新方法，但是由于CAR T细胞治疗时活性不可调控，在部分癌症患者会产生细胞因子释放综合征（cytokine release syndrome）等严重副作用。因此，因此目前临床上正在开发的CAR-T疗法均需要使用药物或者其他方式来可控激活CAR T细胞。

光作为一种时间、空间可控的非侵入性物理因素，也可以作为激活因子应用于CAR T细胞疗法。研究者基于cpLID和iLID光控二聚体系，筛选了多个分裂型CAR的构建组合，最后得到的scFv-hinge-TM-CD28-4-1BB-ssrA-cpLOV2和 4-1BB-SspB-CD3ζ的cpLID组合成功实现了光控的T细胞的激活，并命名为光敏嵌合抗原受体optoCAR。光响应的optoCAR T细胞可以特异性识别CD19肿瘤抗原，导致T细胞活化、增殖并且行使对Raji淋巴瘤细胞的杀伤。

在小鼠实验中，研究者利用了上转换纳米颗粒（UCNPs）来克服可见光组织穿透力低的障碍，将机体高穿透性的红外光转换成蓝光来激活注入小鼠体内的optoCAR-T细胞，从而在动物模型实现了针对淋巴瘤的高效光控治疗。

optoCAR-T疗法较好的时间空间控制以及可逆激活的能力，使得治疗的脱靶效应毒性可以大大减小，在不损失肿瘤杀伤效果的同时，有望减少副作用的产生。研究者也计划在后续进一步地尝试开发针对多种癌症的光控optoCAR-T免疫疗法。

图：optoCAR的设计以及在小鼠实验中对Raji淋巴瘤的治疗效果

总而言之，研究者通过循环排列的方式开发了新型光遗传学工具cpLOV2，作为对LOV2的有力补充，可以结合不同效应子实现多种不同光遗传学工具的设计和应用，从而在一定程度上简化了合成生物学和光遗传学相关工具的开发流程，并实现了新型光遗传学应用的拓展，对于生物医学和生物技术应用来说具有重要的意义。

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41589-021-00792-9