Neuron：C9orf72缺失促进小胶质细胞介导的衰老和淀粉样蛋白积累过程中的突触丧失
C9orf72重复扩增会导致遗传性肌萎缩侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis, ALS)和额颞叶痴呆(frontotemporal dementia, FTD)，并导致C9orf72蛋白表达缺失，潜在毒性RNA和双肽重复蛋白的产生。
除ALS/FTD外，C9orf72重复扩增已被报道出现在一系列神经退行性综合征中，其中包括阿尔茨海默病。
据此，加州大学和西达赛奈医疗中心的研究人员于近日在《Neuron》发现：C9orf72缺失促进了小胶质细胞内稳态特征的改变，并向炎症状态的转变，其特征是I型干扰素（IFN）特征增强。
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C9orf72缺失的小胶质细胞可以触发年龄依赖的神经元缺陷，特别是增强皮质区突触修剪，导致小鼠学习和记忆行为的改变。有趣的是，在淀粉样蛋白积累的小鼠模型中，C9orf72缺陷的小胶质细胞促进了突触丧失和神经元的缺陷，然而却改善了淀粉样斑块的清除。
这些发现表明，C9orf72表达的降低导致小胶质细胞功能的改变，直接导致重复扩增载体的神经退行性变，而且不依赖于功能获得毒性。
1.C9orf72缺陷的小胶质细胞显示出转录特征改变和炎症状态增强
为了研究C9orf72缺失是如何改变小胶质细胞功能的，作者首先对来自青年(3个月)或老年(17个月)C9orf72+/+、C9orf72+/-和C9orf72-/-小鼠的Cd11b+的小胶质细胞进行了RNA测序。主成分分析(PCA)显示，所有基因型在3月龄时出现聚集，但在17月龄时，C9orf72-/-小鼠与C9orf72+/+和C9orf72+/-/动物出现分离。
作者前期结果显示，C9orf72-/-小胶质细胞3月龄时显著上调的单基因表达模块，在17月龄的C9orf72-/-和C9orf72+/-均出现上调。此模块中的基因包括炎症小体成分以及参与MHCII抗原呈递的内吞酶体成分，这说明C9orf72在小胶质细胞的抗原呈递和炎症中起关键作用。
最近一些研究的RNA-seq结果显示C9orf72-/-中稳态小胶质细胞标志物相比于WT小鼠减少，但I型干扰素应答小胶（interferon response microglia，IRM）的标志物和细胞因子水平升高。为了确定C9orf72-/-小胶中的转录水平的变化，作者对12个月龄的C9orf72+/+、C9orf72+/-和C9orf72-/-小鼠的皮质小胶质细胞进行了单细胞RNA测序（single cell RNA-seq）scRNA测序。
聚类分析显示所有基因型的16个小胶质细胞亚群，并且富含ARM基因簇(cluster 11)和IRM基因簇(cluster 13)的是两群完全不同的细胞亚型。同时，模块分数分析显示，在C9orf72+/-和C9orf72-/-中这两个模块的ARM分数都有所下降，但IRM模块得分均增加。这些数据证实了验证了之前RNA-seq的观察结果，即C9orf72-/-小鼠的ARM基因表达降低，IRM基因表达增加。
为了研究C9orf72-/-小胶质细胞也显示I型IFN反应和下游干扰素刺激基因(interferon-stimulated genes，ISGs)的变化，作者进行了分子水平检测，发现小胶质细胞在GMP-AMP (cGAMP)刺激下基础STING蛋白水平升高，且ISGs中的CXCL10和Mx1基因的产生增强。
这些数据表明，小胶质细胞中C9orf72的缺失导致年龄依赖性的ARM基因表达减少和IFN应答基因表达增加，这可能是由STING活性增强驱动的。
C9orf72−/−小鼠的小胶质细胞转录组谱改变
2.老年C9orf72−/−小鼠表现出溶酶体缺陷、小胶质细胞增生和运动皮层突触末端补体介导的剪切功能增强
因为小胶质细胞是大脑中C1q的主要来源，并且在衰老和神经退行性疾病中可以观察到C1q表达增加，因此作者对补体蛋白C1q进行免疫染色，发现C9orf72−/−小鼠相对于WT小鼠来说，其运动皮质中C1q的免疫反应性显著增加。
作者还观察到12个月时皮质突触蛋白显著减少，通过免疫染色和免疫印迹评估，突触素（synaptophysin），vGLUT1和PSD95显著减少。值得注意的是，杂合动物在12个月时C1q、突触素和vGLUT1水平没有明显变化。
另外，C9orf72−/−鼠中补体沉积增加，突触标记物减少，同时树突状分枝和神经突起长度明显减少。这些结果说明C9orf72基因的完全敲除可以导致突触和神经元形态的明显异常。
为了进一步确定补体沉积和突触丢失之间的关系，作者在WT及C9orf72−/−鼠的运动皮质中共同标记了C1q和vGLUT1，结果显示C9orf72−/−中C1q与vGLUT1+的共标记斑点显著增加，而此现象在这个年龄(12个月)的WT小鼠中是很少观察到的。
作者还发现在C9orf72−/−小鼠中Iba1+的小胶质细胞中vGLUT1和PSD95的积累显著增强，说明它们吞噬了突触。为了研究C9orf72−/−中的突触丢失是否导致这些动物行为异常，作者使用巴恩斯迷宫(Barnes maze，BM)来检查小鼠的空间学习和记忆能力。
结果发现，C9orf72+/+、C9orf72+/-小鼠在测试过程中显示了潜伏期时间的稳定减少，这表明这些动物进行了空间学习。然而，C9orf72−/−发现逃生通道的潜伏期时间增加了，说明其空间记忆受损。
综上这些结果说明，在老年小鼠中，C9orf72−/−小胶质细胞导致了异常的神经元树突状形态和补体介导的突触丧失，从而导致认知缺陷。
3.小胶质细胞中C9orf72的缺失再现了C9orf72-/-小鼠中观察到的突触表型
为了确定C9orf72重复扩增本身是否会影响神经元的突触结构与功能，作者将WT和C9orf72-/-神经元进行原代培养14天，结果发现，在单培养神经元的情况下，无论是突触前蛋白(synaptophysin，vGLUT1和Bassoon)还是突触后蛋白(Homer和PSD95)在WT和C9orf72-/-神经元之间的表达模式都没有改变。这些结果表明，在体外基础条件下，C9orf72的缺失不会导致皮层神经元中突触蛋白水平的任何显著变化。
接下来，作者将WT和C9orf72-/-小胶质细胞添加到原代培养的WT皮质神经元（已培养14天）中，并维持2天，然后对所有培养物固定并进行免疫染色和分析。
结果显示，与WT神经元/WT小胶质细胞相比，WT神经元/C9orf72-/-小胶质细胞共培养的突触素密度下降，提示C9orf72-/-细胞的吞噬功能增加。另外，作者发现C9orf72-/-小胶质细胞中突触素阳性的斑点明显增加，也印证了这一点。
为了进一步评估C9orf72缺失在小胶质细胞中的作用，作者在研发了一种骨髓亚群体中选择性耗尽C9orf72的C9orf72fl/fl:Cx3cr1cre+小鼠，包括在小胶质细胞中的C9orf72。
对12个月大的C9orf72fl/fl:Cx3cr1cre+小鼠的运动皮质进行分析，发现小胶质细胞中有CD68+溶酶体聚集，重现了C9orf72完全敲除小鼠中观察到的表型。
同时，作者还发现C1q表达增加，突触素和vGLUT1水平下降，与C9orf72全敲除表型相似。对C9orf72fl/fl:Cx3cr1cre+小鼠的C1q和vGLUT1双免疫染色显示，C1q沉积在vGLUT1+斑点附近，这些结论支持了这些突触是被清除的。
最后，在C9orf72fl/fl:Cx3cr1cre+动物的小胶质细胞中发现vGLUT1+和PSD95+斑点数量增加。总之，这些结果支持了小胶质细胞中C9orf72缺失会自主驱动吞噬活性并诱导神经元突触缺失。
4.在AD小鼠模型中，C9orf72−/−小胶质细胞清除淀粉样斑块能力增强
为了评估C9orf72缺失对淀粉样蛋白病理的影响，作者将C9orf72−/−小鼠与5XFAD转基因小鼠杂交。5XFAD转基因小鼠是一种淀粉样蛋白沉积模型，以前曾用于检测改变的小胶质功能对Aβ积累的影响。
由于该模型在3个月后迅速积累Aβ，6个月时斑块负荷较大，因此作者在5XFAD、5XFAD/C9orf72+/−和5XFAD/C9orf72−/−小鼠的冠状切片上对Aβ聚集物进行染色，发现6个月时5XFAD/C9orf72−/−小鼠与其他基因型相比，皮质和海马区的Aβ和淀粉样斑块积累明显减少。
在6个月时，小胶质细胞的总数在不同基因型中是类似的。然而5XFAD/C9orf72−/−小鼠的斑块比5XFAD鼠更小、更致密。且在5XFAD/C9orf72−/−中有更多的小胶质细胞聚集在斑块周围。
5.5XFAD/C9orf72−/−小鼠小胶质细胞介导的突触修剪增强
作者接着研究了C9orf72−/−小胶质细胞如何改变其功能和炎症特性，及如何影响5XFAD斑块积累过程中的突触完整性。因为在4个月时5XFAD小鼠淀粉样斑块只是最近才积累，而没有神经元损失。因此作者观察了4个月时5XFAD/C9orf72−/−动物突触素和vGLUT1以及突触后标记物PSD95的表达情况，发现其表达均减少。
为了确定增强的突触丧失是否是由补体介导的剪接引起的，作者对C1q和vGLUT1进行了共染色，发现与5XFAD相比，5XFAD/C9orf72−/−小鼠的运动皮质中C1q和vGLUT1双阳性斑点增加。作者还观察到5XFAD/C9orf72−/−小鼠中Iba1+小胶质细胞内vGLUT1+和PSD95+物质的积累增强，进一步证实小胶质细胞吞噬突触蛋白。
为了确定在5XFAD/C9orf72−/−双转基因小鼠中是否存在与增强的早期突触丢失相关的行为，作者进行了BM试验。发现5XFAD/C9orf72−/−小鼠与其他所有基因型(包括5XFAD)相比，首次潜伏期增加，而通常在这个年龄只有轻微的损害。这表明C9orf72缺陷加重了这些动物的空间学习和记忆缺陷。
总之，这些数据表明，在AD小鼠模型中，C9orf72−/−小胶质细胞功能状态的改变抑制了细胞外淀粉样斑块生长的能力，同时也增强了突触丧失、记忆缺陷和神经元损伤。
5XFAD/C9orf72-/-小鼠的小胶质细胞中溶酶体积累增多，神经元和突触缺陷增加
参考文献
Deepti Lall, Ileana Lorenzini, Thomas A. Mota, C9orf72 deficiency promotes microglial-mediated synaptic loss in aging and amyloid accumulation, Neuron, 2021, ISSN 0896-6273
https://doi.org/10.1016/j.neuron.2021.05.020.
编译作者：Sheena(brainnews创作团队)
校审：Simon（brainnews编辑部）