Nature子刊：新型光遗传学工具ChR2-mGluR2-PA——精确定位神经元轴突末端
本文来源于“维真生物”
光遗传学是一项结合了光学及遗传学的技术，它利用光敏离子通道蛋白对特定神经细胞进行精准、快速的时空控制，不仅在科学研究上大放异彩，在神经类疾病的治疗中也展现出巨大的潜力。目前多种光敏激活型和抑制型蛋白已先后被人们认知，其中，光激活型阳离子通道蛋白ChR2及其变体应用较为广泛。
近年来，科学家们通过将光敏蛋白ChR2与多种亚细胞定位标签相融合使光遗传学技术得到了进一步发展。虽然定位标签修饰的ChR2变体极大促进了靶神经元的局部及有效激活，然而到目前为止，能选择性沿着神经元远程轴突传递以实现精确的突触前激活的ChR2变体仍未被开发。
因此，有必要开发轴突导向的新型ChR2工具，使光遗传学工具在体内外更优先刺激轴突投射并控制突触传递，为神经环路的研究提供更多可能性。
近日，日本山梨大学研究人员在Communications Biology上论述了新型光遗传学工具ChR2-mGluR2-PA可特异性靶向神经元轴突末端，诱导长距离轴突末梢的突触传递，并在尖峰碰撞试验中降低多突触噪声有效识别轴突投射。文章题为“An engineered channelrhodopsin optimized for axon terminal activation and circuit mapping”。
研究人员发现向ChR2添加定位信号mGluR2-PA标签(代谢型谷氨酸受体2（mGluR2）C端与蛋白水解基序和轴突靶向信号融合而成)，能将ChR2-YFP优先定位于轴突末端而不干扰其正常的功能，并且能以较低的光刺激水平诱发突触反应。
在尖峰碰撞试验中，mGluR2-PA标记的ChR2能有效识别轴突投射，显著减少多突触过量噪声。本研究证实mGluR2-PA标签有助于促进ChR2向神经元轴突末端的运输，为光遗传学技术在神经回路研究中的应用提供了更多的可能性。
突触前定位标签的筛选
首先，研究人员选择了四种突触前定位的蛋白（CAST、RIM1、mGluR2、MBD），并将其相互作用域分别与ChR2(H134R)-EYFP融合，借助AAV-DJ载体评估各融合物在原代海马神经元中的表达及定位，通过筛选发现只有mGluR2标签标记的ChR2不仅表达正常，且能实现突触前特异性定位，因此，研究人员选取mGluR2标签进行了进一步评估和改进。
通过在ChR2-YFP-mGluR2后插入PEST和ATE序列（ChR2-YFP-mGluR2-PA），显著抑制了ChR2在神经元胞体和树突的表达。ChR2-YFP信号与突触前活动区（Bassoon）、轴突（Tau）及树突（MAP2）标记物进行共定位显示，mGluR2-PA大大降低了ChR2-YFP与MAP2的树突共定位，但未影响其在突触前和轴突的正常表达。
上述研究证实mGluR2-PA可作为在远端轴突和轴突终末定位ChR2-YFP的候选标记。
图1.突触前定位标记的筛选
mGluR2-PA标记ChR2-YFP的体内突触前定位
接着，研究人员也观察了mGluR2-PA标记的ChR2-YFP在小鼠体内的定位。将AAV-ChR2-YFP和AAV-ChR2-YFP-mGluR2-PA分别注射到小鼠海马CA3区/运动皮层M1区，比较在对侧投射区的表达情况，结果显示在mGluR2-PA标签存在下，投影区(对侧)与注射区(同侧)的荧光强度(FL)之比明显更高，且在胞体和树突中没有发现异位表达。
此外免疫电镜结果显示，mGluR2-PA标记实现了ChR2-YFP信号在突触前末端的有效积累。上述结果证实，mGluR2-PA标签有效降低了ChR2-YFP在树突和胞体的表达，而增强了在远端轴突和轴突终末的表达。
添加突触前标记的ChR2-YFP的生理验证
此外，研究人员还通过体内电生理实验对添加突触前标签是否会对神经元功能造成影响进行了验证。通过使用AAV载体在臂旁核（PB）的谷氨酸能神经元中表达这些ChR2的变体，光刺激PB-CeA通路轴突终末后，分析CeA神经元的突触反应，发现从脑干至杏仁核的长距离投射中，在ChR2上添加突触前标记对其诱导光诱发的兴奋性突触后电流（leEPSC）的功能和突触前释放的内源性特性没有不良影响，而阻断钠离子通道（添加河豚毒素TTX）后，所有组的leEPSC均消失，这说明ChR2的光刺激是在突触前终末诱发的动作电位，导致突触传递。
图3.添加突触前定位标签的ChR2功能验证
mGluR2-PA标记的ChR2-YFP有效诱导突触反应
基于上述结果，研究人员认为mGluR2-PA是更为理想的ChR2突触前标记，可以更有效地诱导突触反应。又通过研究CeA神经元的光刺激强度与动作电位的关系，证实了在较低的光刺激强度下，mGluR2-PA标记的ChR2依然能诱导正常的leEPSC，同时需要更强的光刺激才能激发神经元胞体和树突的动作电位，再次说明mGluR2-PA标签优先在轴突末端积累ChR2，并抑制胞体和树突区域ChR2的表达。
mGluR2-PA标记的ChR2-YFP在尖峰碰撞试验中的应用
光遗传尖峰碰撞测试是一种记录神经元轴突投射的强有力方法。ChR2在神经元不同部位的广泛表达，会引起不必要的尖峰碰撞，引起尖峰噪声，大大降低空间分辨率和效率。
ChR2在轴突末端的优先定位有望提高光遗传尖峰碰撞试验的分辨率和效率，由此，研究人员验证了ChR2-mGluR2-PA是否可以代替ChR2应用于光遗传尖峰碰撞试验中。
结果表明，ChR2 和ChR2-mGluR2-PA组，光诱发的反向尖峰在与自发尖峰碰撞时均完全消失，但与ChR2组相比，在光刺激后1000ms内，ChR2-mGluR2-PA组多突触噪声显著减少，表明mGluR2-PA标记的ChR2具有较低的尖峰噪声。
这些结果表明，噪声更小的mGluR2-PA标签适合光遗传尖峰碰撞检测。
获知更多研究结果可阅读原文：
https://www.nature.com/articles/s42003-021-01977-7
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