2021诺奖 | Piezo封神之路（下）
The following article is from 返朴 Author 刘文豪
2021年10月4日，诺贝尔生理学或医学奖授予了发现温度觉和触觉受体的两位科学家David Julius和Ardem Patapoutian。在上一篇文章中，我们详述了触觉受体Piezo蛋白的发现经过和分子层面的研究过程。
伴随着分子水平研究的兴起，Piezo生理功能的研究亦如火如荼。人们发现，Piezo参与的机械感觉相关的生理过程远比想象的要广。从直观的触觉、本体感觉到生命最基础的细胞分裂、增殖，都有Piezo的身影[1]。而且，不仅限于哺乳动物，在鸟类[2]、斑马鱼[3]、果蝇[4-6]、植物[7-9]等其他物种中，Piezo均参与了机械力传导的生理过程。可见Piezo在进化上的功能保守性和重要性。今天我们将着重从哺乳动物Piezo的生理角色出发，介绍与之相关的生命活动过程。
合抱之木，生于毫末——Piezo1与血管功能
我们常用蓬勃有力之心脏，汩汩流淌之血液来形容生命力的旺盛。作为载体的血管，无时无刻不接受着血流的冲刷。血液对血管会造成两种类型的力学作用，一种是血流摩擦血管内皮的流体剪切力，一种是血流挤压血管壁造成的牵张力。
这些显而易见的力学过程自然被学者们与Piezo联系起来。2014年，英国利兹大学的David Beech与美国Scripps研究所的Ardem Patapoutian课题组均发现：基因敲除Piezo1，会造成胚胎鼠的死亡。胚胎鼠死亡的时间点是妊娠中期，这正是胚胎中血流出现的时间，由此，他们推断是Piezo1的缺失导致了血管发育的异常[10, 11]。
研究人员进一步找到了分子水平的解释：血流剪切力可打开机械门控Piezo1通道，使钙离子流入内皮细胞内；钙离子启动下游信号通路，解除内皮细胞的锚定，让它们可以随血流方向迁移、重排并逐步成熟。如此，就启动了血管的发育[10]。
此外，在成年鼠体内，血流剪切力打开血管内皮细胞的Piezo1使钙离子内流后，会释放一氧化氮，使血管舒张[12]。小动脉的平滑肌细胞上亦有Piezo1，血流造成的血管壁的牵张激活Piezo1后也会造成钙离子内流。继而，造成血管壁增厚，管腔缩小[13]。同时表达Piezo1和Piezo2的岩神经节和结神经结的末梢会投射到主动脉弓和颈动脉窦的血管壁上，形成血压感受器。在这些神经上同时敲除Piezo1和Piezo2后，会造成小鼠高血压和血压不稳定[14]。
血管遍布全身，盘根错节，一个成人的血管总长可绕地球赤道2.5圈——如此巨大而精密的生命机器，竟全起源于Piezo这样微小的蛋白质分子。恰如《道德经》所言：合抱之木，生于毫末。
非洲的卡西莫多——Piezo1与红细胞功能
力的作用是相互的。既然血管受到血液如此广泛的力学作用，那血液自身必然也受到机械力的影响。血液中含量最丰富的红细胞随血液流动时，不仅会遭受流体剪切力，还有血液渗透压变化带来的细胞膜张力改变，以及通过毛细血管时受到的挤压和摩擦。这些过程会和Piezo相关吗？
答案是肯定的。在2012年，学者们发现人类的遗传性干瘪红细胞增多症就与Piezo1基因突变有关。罹患该病的个体的红细胞形态干瘪、易破裂，并且有一定程度的溶血[15]。随后，研究者进一步在鼠的红细胞中发现了Piezo1的表达，并且确定了这一血液病的分子机制：基因突变造成Piezo1功能增强，通道开放的时间异常增加，钙离子内流增多，导致细胞膜上的钙激活的钾通道KCa3.1持续打开，细胞内的钾离子和水持续流出到细胞外，造成了红细胞干瘪[16]。
令人震惊的是，在非洲人群之中，竟然有多达1/3携带有此类突变！导致红细胞功能异常的突变为何能长久存在于基因组中？这让我们联想到镰刀形细胞贫血症：红细胞容易破裂，也许是为了阻止疟原虫在胞内持续生长，从而使个体能在疟疾区生存。事实也正是如此，2018年，Ardem实验室在鼠的红细胞Piezo1上引入这一突变，小鼠确实获得了对疟原虫的抵抗力[17]。
雨果曾说：“丑就在美的旁边，畸形靠近着优美，粗俗藏在高尚的背后。”
异常的红细胞就像《巴黎圣母院》中的卡西莫多，虽外形丑陋，却有一颗美好的内心，守护非洲人民免于疟疾之患。
而这颗心，正是Piezo。
破立之间——Piezo1与骨生成和修复
骨是一个高度动态的系统，它可以依据自身所受的力来调节质量和强度。例如，网球运动员惯用手的骨密度就高于非惯用手[18]。人若长期处于缺乏力负载的环境下——比如航天失重或长期卧床——骨密度和骨质量都会明显丢失，从而使骨折的风险更大。而骨量的变化和三种细胞密切相关，分别是位于骨表面能产生新骨的成骨细胞、深埋在成熟骨组织内的骨细胞、以及可吸收骨的破骨细胞[19]。
在骨组织感受力的过程中，是否也有Piezo的一席之地呢？
2019年，两个研究证实了Piezo1在此过程中的关键作用。成骨细胞的前体细胞可响应机械力产生电流，敲除Piezo1后，电流就会消失。在鼠的成骨细胞和骨细胞中特异性敲除Piezo1，鼠的骨形成、骨强度和骨结构都受到影响。并且，敲除Piezo1所导致的骨丢失无法通过增加骨的力负载来恢复。
更有意思的是，给野生型小鼠注射一种激动剂Yoda1，特异性地激活Piezo1，能让其长骨骨量显著增加。这提示我们或许可以将Piezo1作为分子靶点，治疗由航天活动或病理原因引发的骨丢失[20, 21]。
吐故纳新——Piezo与呼吸系统
自2019年12月开始，一种全新的冠状病毒肆虐全球。这种与17年前的SARS病毒同宗同源的病毒同样攻击人类肺部，危重症患者将面临严重的呼吸窘迫[22]。在我们呼吸的过程中，肺部持续受力，肺部呼吸感知和频率的调节自然与肺部的机械力受体密切相关，Piezo在这类感知过程中同样扮演了重要角色。
肺泡内皮细胞Piezo1的激活可保护肺泡-毛细血管屏障结构的完整性[23]。因此，将Piezo1作为药物靶点，有可能帮助重症病人避免呼吸机引起的肺损伤。
在神经嵴、节状神经节等感觉神经中表达的Piezo2对呼吸的调控至关重要。在这些神经中，Piezo2缺失或突变会造成新生儿呼吸窘迫，或是肺部扩张、呼吸的起始、呼吸节律等异常[1]。例如，分布在肺部的迷走神经可感知肺牵拉而兴奋，并调节呼吸节奏。但在这些神经中敲除了Piezo2之后，迷走神经感知肺牵拉的能力大幅受损，同时造成呼吸异常[24]。
呼吸是生命活动的典型特征，我们由此与外部气体世界交互，获得氧气，并排出二氧化碳。每一份呼吸，每一次吐纳之间，都是Piezo赠予我们的生命之礼。
触摸世界——Piezo2与躯体机械感觉
微风拂面，细雨沾肤，这是轻微的触觉；头悬梁，锥刺股，这是伤害性的机械痛觉；高空走钢丝，这是感知躯体平衡和四肢方位的本体感觉的极致体现。
这三类感觉是最直观的机械感觉，统称为躯体机械感觉。躯体机械感觉产生的第一步，是激活背根神经节（DRG）或颅感觉神经节的初级感觉神经。这些神经的一端穿入脊柱，并与下一级神经连接，传递信号到脑部，形成感觉。而神经的另一端则分布到外周感受器里，它们能直接感受到机械力刺激并产生神经信号，这就是躯体感觉的开始[25]。遍及我们全身的外周感受器就是我们日常触觉、痛觉和本体觉的基础。
以最大的器官——皮肤为例，背根神经节（DRG）的神经纤维分布到皮下，特化成各类机械感受器。轻触觉感受器需要响应较小的力，是低阈值机械感受器（LTMRs），主要有无毛皮肤（例如手掌）中的特殊细胞（默克细胞Merkel cells）和各类神经末梢小体（鲁菲尼末梢Ruffini ending、梅斯纳尔小体Meissner corpuscle和帕西尼小体Pacinian’s corpuscle）以及有毛皮肤（例如手背）中的特殊细胞（默克细胞Merkel cells）和环绕毛囊的各类纵向和环形针状的低阈值机械感受器。而痛觉感受器往往响应较大的伤害性机械刺激，是高阈值机械感受器（HTMRs）。在皮肤中，它们一般以自由神经末梢的方式存在[25, 26]。本体感觉的感受器最主要分布在肌肉组织中，主要包括肌梭和肌腱中的本体感觉感受器。它们能感受肌肉的牵张，继而反馈四肢方位和躯体平衡的信息[27]。
既然这些感受器能感知机械力，那么就会有一个核心问题：这些机械敏感细胞上表达的哪种蛋白可以感知机械力呢？也就是上一篇文章开头提出的、无数神经科学家长期追寻的目标。
学者们几经辗转寻找到的机械门控Piezo蛋白家族，会是那个答案吗？
Piezo2在这些感受器中的表达量就很高。事实上，在这些低阈值感受器或默克细胞中把Piezo2敲除之后，实验鼠出现了严重的轻触觉缺陷[28-30]。并且，Piezo2基因突变的人类也表现出轻触觉的缺陷和对纹理触感的障碍[31]。若将本体感觉感受器的Piezo2敲除，实验鼠则会出现严重的躯体平衡和四肢定位缺陷[32, 33]看来那个答案已然找到，Piezo2正是触觉和本体觉的受体蛋白！
然而Piezo2并不是完美的答案。从这些感受器敲除Piezo2并不影响机械痛的感知[29]，甚至某些情况下使痛觉感知更敏感[34]。但稍令人欣慰的是，对于一类特殊的痛觉——触摸超敏痛和痛觉过敏（例如皮肤上出现创伤时，轻微的触碰都会引起剧烈疼痛），Piezo2是直接相关的蛋白[35, 36]。因此，那个直接负责痛觉感知的受体蛋白，仍然隐藏在迷雾中，仍让科研人员们“痛”并快乐着。
触觉感知赋予我们识别物体、区分纹理、感官运动反馈和社交的能力[25]。痛觉过敏警示我们需要保护脆弱的伤口，避免了二次伤害。Piezo2，见证着无数我们习以为常却至关重要的触、痛瞬间。
而关于本体感觉，则有一个古老的故事：数百万年前的那场体态革命，南方古猿抬头挺胸直立行走，从而解放了双手，人类自此开始了问鼎生物圈的征程。习惯双脚行走的过程也是场本体感觉的革命，而Piezo2，正是这场革命的亲历者。
一念成佛，一念成魔——Piezo相关疾病
前面我们介绍了Piezo通道在生理过程中扮演的重要角色：Piezo1作为血管内皮细胞流体剪切力感受器参与胚胎血管生成、成体血管形态调控；Piezo1和Piezo2共同作为动脉血压感受器调节血压；Piezo1作为红细胞膜上流体剪切力感受器调控红细胞体积；表达在成骨细胞和骨细胞上的Piezo1感知骨受力从而调节骨量；在肺泡中的Piezo1和肺部神经中的Piezo2分别参与保护肺泡屏障和调节呼吸节律；Piezo2表达在感知外周躯体机械觉的背根神经节（DRG）和颅神经节中，作为触觉、痛觉过敏和本体感觉的力感受器起始躯体机械觉的感知。
除此之外，Piezo还在干细胞命运决定[37, 38]、天然免疫[39]、上皮细胞稳态[40, 41]、脂肪细胞生长[42]、骨损伤修复时血管生成[43]、肠道功能维持[44-46]、维持心脏功能稳态[47]、排尿控制[48]、介导小鼠超声听觉[49]等等诸多力学生理过程中，作为机械力感受器，发挥着重要功能。生理功能相关成果的大量涌现，愈发凸显Piezo在哺乳动物整体生命活动中的重要地位。
功能如此重要，意味着一旦出现异常，后果也将很严重。前文所述的Piezo各类生理功能研究多是在实验鼠层面进行基因敲除，观察到严重的功能缺陷而确定的。现在，也已发现人群中的部分遗传病与Piezo基因的突变直接相关。
一类是功能缺失型突变。此类突变使Piezo功能减弱，导致机械敏感性变差，或离子通透能力减弱。在人群中，Piezo1的此类突变会造成先天性淋巴管发育不良（淋巴水肿）[50, 51]；Piezo2基因的此类突变则会导致隐性远端关节挛曲综合症、脊柱侧凸、触觉和本体感觉缺陷、肌肉萎缩、新生儿呼吸窘迫[31, 52]等众多疾病。
另一类是获得功能型突变。这种突变使Piezo功能过强，通道的机械敏感性增强，持续开放时间延长而使阳离子持续内流，造成细胞功能紊乱。人类携带Piezo1的此类突变将会罹患遗传性干瘪红细胞增多症[53-55]，Piezo2的此类突变则会导致显性远端关节挛曲（3型和5型）[56]。
异常的Piezo成为病魔之源，这提示Piezo能作为疾病治疗的药物靶点，有医药应用的前景。
至此，研究人员们从蛋白的发现，到分子水平的结构功能，到生理功能，再到病理过程等各方面对机械敏感Piezo蛋白家族有了较系统的了解。然而，在Piezo和机械感知领域的上空，依旧飘着几朵乌云：在分子水平，Piezo蛋白究竟是如何开放、失活和关闭的，还不得而知；部分Piezo1获得功能型突变所致的干瘪红细胞增多症病人同时也表现出功能缺陷型病人才有的淋巴管发育不良，反之亦然[57]；人类中Piezo1功能缺失的个体并不会像鼠一样胚胎致死[1]，这暗示了人类存在其他机械敏感蛋白可参与Piezo1相关生理过程；背根神经节（DRG）里敲除Piezo后依旧有机械敏感性[29, 58]，这强烈提示了其他机械门控通道的存在；Piezo2参与介导痛觉过敏但并不直接介导机械痛[35, 36]。并且，在背根神经节（DRG）里敲除Piezo2之后痛觉感知反而更敏感[34]，这说明介导机械痛觉的另有其人。
是乌云，也是机遇，我们仍大有可为。
科学家们在认识世界的时候，都会有改造世界的使命感。在Piezo领域，开发靶向Piezo的药物，将对基础科研和疾病治疗大有助益。基于Piezo的机械敏感性发展相关生物技术，或有可能实现机械力遗传学，为操纵特定细胞的基因表达创造了新的可能性。为了将Piezo推向应用，科学家做过哪些尝试呢？
原力与你同在——Piezo靶向药物
离子通道可以被特定的化合物激活或抑制，例如，辣椒素就能结合并打开TRPV1通道，这就是我们能感受到辣味的原因[59]。这些靶向离子通道的特定化合物可进一步用在基础科研和临床药物开发上。例如，辣椒素就已广泛应用于TRPV1结构功能的研究。学者们还利用TRPV1介导痛觉并在激活之后脱敏的特点，将辣椒碱用作镇痛药物[60]。
目前，在药物开发领域，离子通道是一大类药物靶点。Piezo参与了诸多重要的生理过程，并与多种疾病密切相关，自然也可作为重要的药物靶点[1]。另外，Piezo是全新的一类蛋白，若有通道特异的激动剂，对基础研究将大有裨益。
在这样的大背景下，Yoda1和Jedi分子应运而生。
因Piezo可以通透钙离子，研究人员在细胞内加入可指示钙离子的染料或荧光蛋白来指示通道的开放，而后利用荧光成像读板仪进行高通量的小分子筛查。Ardem实验室利用诺华公司的小分子库，在约325万个小分子化合物中鉴定到了Piezo1激动剂Yoda1[61]。而肖百龙课题组则幸运的在筛查了3000个小分子后即得到了可激活Piezo1的Jedi分子[62]。现在，Yoda1已广泛用于Piezo的门控机制和各类Piezo相关生物学过程的研究[63]，而通过Jedi，研究人员提出了Piezo开放时的杠杆模型理论[62]。
Yoda和Jedi的命名皆出自《星球大战》，分别是尤达大师和绝地武士。“原力与你同在”是绝地武士们的信仰，也正契合了这两类小分子作为机械力敏感的Piezo通道的激动剂的理念。
但Yoda1和Jedi分子的药理学性质还略有不足：Yoda1是脂溶性分子，可溶度差[61]，Jedi分子的亲和力较弱[62]。另外，目前用于抑制Piezo的化合物（钌红、Gd3+、GsMTx4）[1]都是较广谱的阳离子通道或机械通道的抑制剂，缺乏特异性。这都意味着我们仍需要找寻更有效更特异的Piezo靶向分子。
未来的曙光——Piezo在生物技术应用上的尝试
操纵特定细胞的基因表达，是生物学家们长久以来的梦想。光遗传学的出现[64]，使得科学家们可以使用激光照射特定神经元来控制其基因表达，大大加速了解析各类神经元功能的进程[65]。但传统光遗传学受限于组织的透光能力，无法用于较深层的组织细胞。因此神经科学家们把目光投向了磁场、超声等具有穿透能力的物理刺激。利用这些物理信息操纵基因表达的核心前提，就是找到能感知此类信号的受体蛋白。
作为哺乳动物中首个被发现的、介导阳离子内流的机械敏感通道，Piezo家族立刻吸引了科学家的目光。2018年，研究人员成功将Piezo1用于超声控制的CAR-T细胞的基因表达[66]。
CAR-T细胞技术是近年来肿瘤免疫中炙手可热的领域。它通过在T细胞中表达特定的、可以识别肿瘤细胞的受体，来实现肿瘤细胞的精确杀伤。然而，这项技术可能存在脱靶效应，会损伤机体的正常组织，甚至危及病人的生命。并且，如何实现CAR-T细胞在特定组织的激活也是难题。为解决这些难题，研究人员把Piezo1表达在了CAR-T细胞上，利用超声引发钙离子内流（还有待严格证明的是：超声是否直接激活了Piezo1，引发钙离子内流）。钙离子的下游可激活转录因子，从而启动CAR受体表达。这样就成功实现了超声控制T细胞基因表达！利用该技术，研究人员只需在特定组织给予超声，就能在局部激活T细胞，精确杀伤肿瘤[66]！
癌症是当下人类面临的最大的健康挑战。Piezo的出现，或为人类对抗癌症之路投下一缕曙光。这缕曙光，也可伴随Piezo的机械敏感性，进入到各种领域中。例如用超声控制神经元，Piezo和光敏蛋白联用等等……这缕曙光也照出了生物技术未来的一个方向。
到这里，Piezo蛋白的故事暂时落下了帷幕。我们分上下两篇，从分子水平的机械敏感通道的存在，Piezo通道的鉴定，Piezo高分辨率三维结构的解析，Piezo感知机械力的方式；到生理水平Piezo参与血管生成和调控，红细胞体积调控，骨量调节，保护呼吸系统并调节呼吸，介导躯体机械感觉，以及Piezo相关疾病；再到应用上，Piezo靶向药物的寻找和Piezo在生物技术上的应用这三个层级讲述了Piezo蛋白的“封神之路”。
Piezo蛋白独特的分子组成、结构以及它在机械传导生理现象中的重要作用，使其当之无愧成为离子通道和机械感觉领域的明星蛋白。但Piezo蛋白的结构功能和生理功能的工作仍有诸多盲点，并且哺乳动物中还有其他机械敏感蛋白的存在（例如近来鉴定到的TMEM63[67]）。这些都说明机械感觉这栋大厦还需大量添砖加瓦。
或许是冥冥之中的注定，在鉴定到Piezo通道2010年，那年的苹果公司发布会上，乔布斯在iPhone4上展示了惊艳世界的感知方位的陀螺仪。但我们不要忘了自身早在数十亿年前的起源之初，就装配了性能上强大得多的躯体位置感知系统。躯体感觉以及我们身体内许许多多的机械感知现象，都是Piezo带来的生命奇迹。
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作者介绍
刘文豪，清华大学生命学院2016级PTN项目博士生，师从肖百龙教授。博士期间主要从事机械门控Piezo通道结构功能关系的研究，曾以共同第一作者在Nature、Neuron发表文章揭示Piezo通道机械门控过程的“双门控”机制和“门塞和闩锁”机制。
2010年，美国Scripps研究所的Ardem Patapoutian课题组在《科学》杂志报道了哺乳动物中首类介导阳离子内流的机械门控离子通道——Piezo蛋白家族[1]，平地惊雷般的开启了一个领域。因与触觉等关键的基础机械感觉关系密切，该蛋白自发现伊始便作为明星分子活跃在各大学术期刊上。Ardem更是因这一发现被授予2021年诺贝尔生理学或医学奖！笔者的导师肖百龙教授曾是Ardem的博后，他见证和参与了Piezo蛋白早期研究的关键工作，独立后在这一领域继续深耕，因而我有幸进入到这一热火朝天的领域中。Piezo蛋白究竟是什么？它们是如何工作的？它们的重要性在哪儿？带着这些问题，让我们一起进入Piezo的世界，一窥科学家们逐步认识Piezo蛋白的过程。
我们对这个世界最初的感知通常是从触觉开始的。第一声啼哭之前，婴儿经历过诱发哭声的拍打；来到人世，感受亲人的爱抚和拥抱；儿时抓周一通乱摸，成长中提笔、拍球、弹拨乐器；日常生活中握手，敲击鼠标键盘，刷手机……触觉充斥着我们日常生活的方方面面。
触觉是躯体机械感觉的一种，除了触觉之外，还有机械痛（区别于日常的轻触觉）、本体感觉（对四肢移动和体位的感知）等也属于躯体机械感觉。这些机械感觉和视觉、嗅觉、味觉和听觉构成了我们日常意义上的五感（听觉也是感知声波振动的一种机械感觉）。
这些基本感觉从形成、传递到感知，生物学过程大体上是类似的：特定的感受器官和细胞上特定的受体接收外界刺激，产生动作电位，这种电信号沿神经突触向中枢神经系统传递，最后到达大脑特定区域，就产生了特定的感觉。在这一过程中，作为最初级受体的一系列蛋白质是十分神奇的存在。
人体的蛋白质都是由20种基本的氨基酸组成。可就是仅仅凭借这20种基本组件的排列组合，生物居然能演化出如此精准强大的、感知外界各种物理化学信号的接收器——受体蛋白。以人类为例，眼睛中的光敏感受体可响应380-780nm波长的电磁波；鼻子中的嗅觉受体可帮助我们分辨出空气中的数万种小分子；味蕾上的味觉受体可分辨苦咸酸甜鲜；人耳中声波的受体可以分辨出各种不同响度、频率和音色的声音；遍布全身的触觉受体能帮我们精确分辨出压力、振动、纹理等多种不同的触觉感受。而在动物中，这些受体的功能往往比人类更加强大。因此，鉴定出这些受体究竟由何种蛋白构成，一直都是神经科学家们孜孜以求的关键目标。
视觉上的研究首开先河，视网膜上的感光蛋白（视紫红质）为德国科学家在19世纪发现，而后在上世纪80年代确定了全长DNA序列[2, 3]。接着，仿照研究视觉受体的办法，科学家们相继鉴定到嗅觉和味觉受体的分子基础[4, 5]，其中嗅觉受体的工作获得了2004年诺贝尔奖。这三种感觉的受体蛋白或在相应感官中高表达，或在基因序列上有高同源性（三者均属于G蛋白偶联受体家族），这两个特点为它们的鉴定提供了条件。
至于余下的两种机械感觉，造物主似乎给我们出了难题：触觉和听觉的受体蛋白的低表达给生化鉴定带来困难，且在基因序列上也不像视味嗅觉般有章可循[6]。凭借遗传筛选，科学家得以在较低等的生物中鉴定到部分机械感觉通道(细菌中的机械通道MscL倒是生化方法获得的[7])。
而在哺乳动物中，这个疑问一直持续到2010年。这一年，Ardem课题组鉴定到了哺乳动物中首类介导阳离子内流的机械门控Piezo阳离子通道[1]，解决了谜题。这一里程碑式的发现为触觉受体的分子基础提供了可能的解释。后续的研究发现，Piezo家族中的Piezo2确实参与触觉感知。
如此重要的一类蛋白是如何千呼万唤始出来的？它的功能是怎样被一步步揭示出来的？今天，我们将从分子水平来讲述Piezo这栋大厦的地基是如何打下的。
在当代生物学研究中，一个好的工作，往往都需要由浅入深的逐步上升到分子水平。具体来说，需要揭示这一过程的各个部分：一个生物学现象的组织器官基础，与之相关的细胞，细胞上行使功能的蛋白，以及编码该蛋白的基因。蛋白质和基因这种分子水平的研究是一个领域的基石。
电光火石——机械力能直接打开离子通道
哺乳动物细胞能产生数万种蛋白，如何从中发现机械敏感蛋白？我们不妨先把问题转化成：哪些蛋白可能响应机械力？
机械力势必引发细胞形态的改变，因此，和细胞膜有密切关系的蛋白都能成为怀疑对象，包括直接定位在细胞膜上的膜蛋白、支持细胞结构的细胞骨架蛋白以及细胞外基质等。
1979年，研究人员用电生理的方法，在牛蛙的听觉上皮细胞记录到了机械力刺激下产生的电流[8]。由于刺激后电流产生的时间在亚毫秒级别（40μs），这个电光火石的瞬间不足以让细胞内第二信使完成信号传递（上述的视觉嗅觉味觉的G蛋白偶联受体就需要借助第二信使产生电流），所以只能是目的蛋白受到机械力后直接产生了电流。这个潜在的机械敏感蛋白，最可能是离子通道[8, 9]。
离子通道是膜蛋白的一种，一般由跨越细胞膜内外的孔道区域和其他辅助元件组成。在受到适当刺激时，孔道区域可打开，依据离子通道对不同离子的选择性和细胞膜内外不同离子的电化学梯度，使部分离子穿越细胞膜，带来细胞膜电位的变化，或由离子自身参与信号传递而形成生物学效应。
无独有偶，1984年，研究人员在鸡的骨骼肌细胞中记录到了由牵拉所致的机械敏感电流，该电流也被认为由离子通道介导[10]。
搜寻范围由此大大缩小——离子通道中就存在着机械敏感蛋白。
图3. 机械力驱动离子通道打开完成阳离子内流丨图片改编自Hoffman, et al., 2011, Nature[11]
上下求索——你究竟是谁？
和G蛋白偶联受体家族不同，不同的离子通道在序列和功能上彼此之间差异巨大，唯一被认可的共性是：都含有两次以上的跨膜区[1]（膜蛋白都需要插入细胞膜的跨膜区，来定位在细胞膜上，最常见的跨膜区是α螺旋）。
如何判定一个通道是机械门控离子通道呢？科学家们制定了以下几条准则：该通道要能直接被机械力激活而无需通过中间信使；该通道参与机体机械传导的过程；在非机械敏感细胞中表达该通道能赋予该细胞机械敏感性；该蛋白有成孔区和机械敏感区[12, 13]。
此等严苛的标准，加上机械敏感通道常常低表达的特性，使得常规生化手段束手无策，仅在高表达的细菌机械敏感通道MscL的鉴定中方有用武之地[7]。而后世找寻其他真核生物的机械通道大都经由遗传筛选得到。遗传筛选是基于中心法则——蛋白质是由基因编码产生。在个体或者细胞中，让感兴趣的基因发生变异，从而导致该基因对应的、行使生物学功能的蛋白质发生变异或不再表达，如果此时机械感觉相关的表现异常，那么该基因就很能作为备选基因。
在易于进行遗传操作的低等物种中，遗传筛选帮助我们确认了部分机械门控离子通道，比如线虫里的DEG/ENaC通道[14, 15]、果蝇的NOMPC通道[16]。而在脊椎动物，尤其是哺乳动物中，要确定机械敏感蛋白，可以寻找这些低等物种机械通道的同源蛋白。但这种方法收效甚微：哺乳动物中或是不存在相关的同源基因，而有同源基因的，其表达的蛋白却没有机械敏感性。此前唯一确定的哺乳动物机械敏感蛋白——K2P家族的作用是使细胞超极化而变得更加“平静”[17]，可是触觉、听觉过程需要让细胞去极化而“兴奋”起来。
那么，我们苦苦找寻的这种受体究竟是什么呢？
学界路漫漫，上下而求索。
平地惊雷——Piezo蛋白横空出世
故事开始于十多年前。彼时，Ardem实验室的博士后Bertrand Coste接下找寻哺乳动物机械门控离子通道这一极具挑战的课题。此前他们已经知道一种鼠源神经母细胞瘤细胞系（N2A细胞）是有较强机械敏感性的：玻璃尖头戳细胞的力刺激和抽吸细胞膜的力刺激均能引发稳定电流。他们试图从这种细胞出发，寻找那个隐藏在重重迷雾里的机械敏感通道。
细胞系易于在体外大量培养，且细胞之间一致性很高，这样的特点允许我们鉴定到细胞内高表达的基因。借助基因芯片，N2A细胞系内高表达的基因被确定。再结合离子通道“至少有两次跨膜”这一特点，他们挑选出一系列备选基因。进一步的，他们用RNA干扰技术逐个抑制备选基因表达，如果某个基因抑制后的N2A细胞失去机械敏感性，那么该基因表达的蛋白极有可能就是那个受体。
事情就这样成了！在Bertrand口中的那个“美妙的时刻”，列表中的第72个基因被抑制后，N2A的机械敏感电流显著下降！这个原名Fam38A的基因后来被命名为Piezo1，同一家族的另一个蛋白Fam38B被命名为Piezo2。Piezo一词起源于希腊语，有“压力、挤压”的意思，用它做名字，寓意该基因是压力受体。
进一步的，他们将Piezo表达在几无机械敏感性的HEK293T细胞系中，成功赋予其机械敏感性。同时，又在哺乳动物传导机械感觉的背根神经节中，发现了Piezo2的高表达，提示了Piezo2和触觉、痛觉感知的密切关系[1]。
这是一件平地惊雷的大事！从此哺乳动物机械力受体研究的历史焕然一新！Piezo蛋白是哺乳动物细胞具有机械敏感性的充分必要条件！
然而，这个研究并不是完美的，它仅证明到Piezo是机械门控阳离子通道至关重要的部分。
那么，Piezo蛋白就是那个通道吗？
生化艺术——真的是通道
上述研究虽然证明了Piezo蛋白对于机械敏感电流的出现不可或缺，但不能排除一种可能：Piezo只是这个机械敏感通道的一部分，仅有辅助和调节功能。那么，Piezo本身就足以实现通透离子的通道功能吗？或者说，Piezo蛋白就是这个机械敏感阳离子通道的通道区吗？
一个证据来自果蝇。研究发现，果蝇Piezo和鼠的Piezo在一些和孔道直接相关的性质上有较大差异，比如通道的电导和抑制剂作用能力很不相同。这说明，Piezo的来源不同，孔道相关的电生理特性不同，这暗示着Piezo本身就是通道[18]。
而更直接的方法是：直接提取纯的Piezo蛋白，并重组到人造的类似细胞膜的脂质体上。如果仍能记录到电流，那便证据确凿。
这就要求我们能提取出保持生理功能的Piezo蛋白——这个步骤称为“蛋白纯化”。
蛋白的纯化需要依据每种蛋白的特点量身定制，膜蛋白提取更是其中很棘手的一类。Piezo是很大的蛋白：超过2500个氨基酸，预测有30次以上的跨膜[1]。并且，离子通道经常以多聚体形式发挥功能，使提纯难度进一步增加。因此，Piezo蛋白的纯化非生化功力深厚者不可为之。
彼时，Ardem实验室的另一个博士后，肖百龙博士，凭借其扎实的生化技术，解决了这一难题。纯化的鼠源Piezo1重组入人工脂质体后，确实记录到了通道开放产生的电流，且该电流能被钌红（一种广谱阳离子通道抑制剂）阻断[18]。后续的工作进一步证明了重组脂质体下的Piezo有机械敏感性[19]。
至此，Piezo蛋白可以被名正言顺的称为“机械门控Piezo离子通道”。
图5. Piezo1是离子通道
A，纯化的Piezo1蛋白的免疫印迹电泳图（western blot），图中黑色条带即为Piezo1蛋白的条带。B，上图，将纯化后的Piezo1蛋白重组到人工脂质体上后可记录到通道开放事件。下图，该通道开放事件可被广谱阳离子通道阻断剂钌红（RR）所阻断。（图片改编自Coste and Xiao, et al., 2012, Nature[18]）眼见为实——电子显微镜下的三叶螺旋桨
Piezo通道在进化上是保守的，从植物到动物都有这一蛋白[1]。但在同一个体内，它和其他的蛋白都不相似。那这个全新的蛋白长什么样呢？它究竟有怎样的架构，竟能感知机械力？以及，它是如何传递机械力，来打开通道的？
单单基于氨基酸一级序列的诸多猜测和实验都不如亲眼所见。此时，Piezo研究呼唤结构生物学登上舞台。
在首篇Piezo论文（2010年）问世后的两三年，冷冻电子显微镜技术发生了质的飞跃。贝叶斯方法的引入和直接电子检测相机（DDD）的使用，让冷冻电镜能够解析近原子分辨率的蛋白质三维结构。2013年，加州大学旧金山分校（UCSF）的程亦凡博士率先使用冷冻电镜解析了TRPV1离子通道（2021年诺贝尔生理或医学奖的另一主角）近原子分辨率结构[20]，这为其他通道结构的解析打入了一针强心剂。
2013年，肖百龙博士来到清华大学组建实验室，恰逢施一公、王宏伟等人布局、搭建了强大的冷冻电镜平台。肖百龙决定与清华的结构研究者们合作解析Piezo通道的三维结构。并率先获得了Piezo1的中等分辨率结构[21]。冷冻电镜技术的突破同样吸引了Ardem和Rod Mackinnon（2003年诺奖得主）的目光，二人随即也投入到Piezo结构解析的工作中。一切都如此顺理成章——合适的人，合适的时间，合适的技术手段——接下来的几年，三方（肖百龙/李雪明，Ardem Patapoutain/Andrew B. Ward，Rod Mackinnon）几乎同时获得了Piezo1的高分辨率结构[22-24]，而Piezo2的高分辨率结构也随后为肖/李合作解出[25]。
Piezo的造型十分独特。它是由三个单体组成的三叶螺旋桨状结构，多达114次跨膜，是已知跨膜次数最多的一类大型膜蛋白。蛋白单体前36次跨膜以每4个跨膜区组成一个单元，共有9个重复性的单元，最后两个跨膜区被认为形成孔道。蛋白整体由外周桨叶部分向中心凹陷成穹顶状（直径28nm，深10nm），中心孔道区域上方有一胞外的帽子结构域（Cap），细胞内侧有一9nm长的长杆结构（Beam），将桨叶外周连接到中心孔道的胞内部分[21-25]。
著名物理学家费曼说过：“你只要看到它，你就能回答许多基本的生物学问题。”
Piezo通道这般别致的结构能告诉我们什么呢？
逐鹿中原——Piezo通道如何感知力？
结构决定功能，世间万物大抵如此。
Piezo这个三叶螺旋桨打开过程中发生了怎样的变化？研究人员有理有据的“脑洞大开”。
Piezo的外周桨叶能将周围的细胞膜向内扭曲凹陷，而其他膜蛋白周围的膜成分一般是平的，这一异乎寻常的现象让研究人员们猜测：机械力作用在Piezo上的时候是不是会将该凹陷展平呢[26]？2003年诺奖得主Rod Mackinnon的课题组发表了两篇文章，论证了展平的可行性以及模型[24, 27]，之后还利用原子力显微镜进一步验证[28]。
依托结构导向的功能机制研究，肖百龙课题组发表了系列文章来揭示Piezo通道的机械门控机制，并提出了系列模型假说，譬如“杠杆模型”假说：胞内的长杆结构可作为杠杆撬开孔道[22, 29]。此外，蛋白上各个结构域的潜在作用也被逐步揭示：桨叶可以作为机械力传导模块[30]；锚定区（anchor）后的连接（linker）作用很关键：内质网蛋白SERCA可通过它抑制Piezo[31]，而E-cadherin蛋白可通过它将Piezo和细胞骨架联系在一起而增强Piezo功能[32]；帽子区可感知、传导机械力，并且决定了Piezo通道从打开到失活过程的快慢[25, 30]；长杆区之后的“门塞”序列可通过“门塞和闩锁”机制完成Piezo三个胞内侧向通路的协调门控[33]。
期待有朝一日，我们能获得Piezo通道从关闭到开放再到失活等全部状态下的结构以及在细胞膜上的原位结构，能将上述各种学说囊括入一个“大统一”框架内。
（未完待续）
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