Nature系列重磅成果发布：大脑运动皮层的细胞图谱！国产fMOST技术助力多篇研究
人脑是一个巨大的信息处理网络，由数十亿个神经元组成，通过数万亿个突触相互连接。但目前对神经元类型的表型分析在分辨率、稳定性、全面性和通量方面仍然受到严重限制，不同的细胞表型（多模态对应）之间的复杂关系仍然存在争论。
单细胞基因组学技术为测量单个细胞的转录组和表观基因组概况提供了分辨率和通量，基于成像的单细胞转录组学及其与功能成像的结合，以及电生理学和单细胞测序的整合，使分子定义的细胞类型的空间组织和关键表型特性的映射成为可能。最后，细胞类型的分子分类使人们能够利用转基因小鼠和基于增强子的病毒载体对特定的细胞类型进行遗传操纵。
所有这些方法都已在独立的研究中应用于脑组织，但尚未以协调的方式建立不同方式之间的对应关系，以及分子遗传框架是否能解释其他功能上重要的细胞表型。
BICCN（BRAIN Initiative Cell Census Network）的总体目标是利用这些技术产生一个开放的脑细胞参考图谱，整合分子、空间、形态、连接和功能数据，描述小鼠、人类和非人灵长类动物的细胞类型。BICCN近期在Nature上发表了一系列关于哺乳动物初级运动皮层多模式细胞普查和图谱的相关研究成果。该联盟还将数据库向大众开放（https://biccn.org），并构建了可以直接应用的软件，从而确保这些数据能够对神经元多样性的性质和起源的研究大有裨益，真正做到数据库落到科研的实际使用之中。
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下面，我们通过一篇总体介绍的文章，来了解BICCN的工作，即绘制了哺乳动物初始运动皮层多层次、多模式的细胞图谱。
定义MOp中的细胞类型
从7个scRNA-seq 和snRNA-seq（sc/snRNA-seq）数据集以及单核甲基-胞嘧啶测序（snmC-seq2）和单核测定转座酶可接触染色质的测序法，得出了小鼠MOp分子分类。
使用这个小鼠MOp转录的分类法对所有数据类型的细胞类型分类，进一步应用SingleCellFusion（SCF）和LIGER，将转录组学和表观遗传学相结合，得出一个集成的分子分类法，包括56种神经细胞类型(与90个转录组的神经元类型相对应）。
为了在小鼠、人类和狨猴之间建立一个共识的MOp和M1细胞类型分类，我们整合了跨物种的snRNA-seq数据集，并确定了45种保守的t类型，包括24种GABAergic类型，并确定了45种保守的T型，包括24种GABAergic (γ-氨基丁酸分泌）、13个谷氨酸能和8个非神经元类型（扩展数据图2a）。各类型之间的相似性被代表为一个共识的分类法，通过使用不同的基因子集来量化分支的稳健性（图1b）。
小鼠Mop的空间分辨细胞图谱
我们使用MERFISH，一种单细胞转录组成像方法，来识别原位的细胞类型并绘制其空间组织图。对MERFISH得到的单细胞表达谱进行聚类分析，在MOp中共有95个细胞集群（42个GABAergic，39个谷氨酸能和14个非神经元）（图2a），这与共识的sc/snRNA-seq分类法在亚类水平上有很好的一对一的对应关系。MERFISH群组的空间分布显示出MOp中复杂的层状分布（图2b）。
许多谷氨酸类群显示出沿着皮层深度的狭窄分布，将皮层细分为单个皮层，虽然经常没有离散的边界。值得注意的是，IT细胞，MOp中最大的神经元分支，形成了一个细胞大体上是连续的梯度，它们的表达谱和它们的皮层之间有相关的渐进变化。
许多GABA能集群也显示出层状分布，倾向于部分居住在一或两层。在非神经元的细胞簇中，VLMCs形成了皮质的最外层细胞。而成熟的少突胶质细胞和一些星形胶质细胞则富集于白质。其他亚类的非神经元细胞基本上分散在各层。
MERFISH分析还显示了有趣的细胞类型沿内侧-外侧和前侧-后侧轴的空间分布。总的来说，MOp中的神经元和非神经元细胞群形成了复杂的空间分布。MOp形成了一个复杂的空间组织，完善了传统上定义的皮质层。
总的来说，MOp神经元的投射不遵循一个简单的 "一个细胞类型到一个目标区域 "的模式，而是形成一个复杂的多对多的网络。
用Patch-seq对细胞类型进行多模态分析
我们使用Patch-seq来描述T型的电生理和形态表型。我们选择了成年小鼠MOp中的1,300多个神经元，记录它们的一组电流步骤的电生理反应，用生物细胞素填充它们，生物细胞素来恢复它们的形态（大约50%的细胞），并使用Smart-seq2测序获得它们的转录组。
我们将这些细胞映射到小鼠MOp转录组分类法(图1a)，可将细胞分配到77个T型（图3a），从而描述了大多数谷氨酸能和GABA能T型的形态-电学表型。
我们发现，形态电学表型在很大程度上是由转录组亚类决定，不同的亚类有不同的表型。然而，在每个亚类中，T型之间的形态-电学特性有很大的差异。这种变化不是随机的，而是有组织的。
因此，在主要的转录组亚类中，形态-电学表型和/或体细胞深度经常在相邻的T型之间平稳地变化，很少有T型是完全同质的。
通过Epi-retro-seq进行多模态对应
为了了解投射神经元的分子多样性，我们开发了Epi-retro-seq，它结合了逆行追踪和表观基因组分析，并将其应用于小鼠MOp神经元，投射到接受MOp输入的八个选定的脑区（图4a）。目标区域包括两个皮层区域，SSp和前扣带区（ACA），以及六个皮层下区域，纹状体（STR）、丘脑（TH）、上丘（SC）、腹股沟区和黑质（VTA+SN）、盆和延髓（MY）。
我们获得了2,115个MOp投射神经元的甲基组，将它们与没有富集到特定投射的MOp神经元共同聚类，观察到所有主要细胞亚类之间的精确一致（图4b, c）。
IT亚类（L2/3、L4、L5 IT、L6 IT和L6 IT Car3）中皮质-皮质和皮质-纹状体投射神经元的富集，以及L5 ET中皮质-皮质下投影神经元的富集。在L6 CT也观察到许多皮质-丘脑投射神经元。
与逆行标记的特异性相一致，与MOp中无偏见的神经元收集的定量比较表明，在预期的亚类中至少有30倍（IT）或200倍（ET）的神经元富集。投射神经元的表观基因组图谱数据促进了对建立神经元身份和连接的基因调节的理解。
细胞类型靶向工具
对特定的神经亚群和前体细胞的遗传研究是多模式分析的必要条件，以验证t-类型，绘制其发育轨迹，并研究其在环路中的功能。在这里，我们提出了一个遗传工具包，用于解剖和绘制谷氨酸锥体神经元（PyN）亚群的命运，主要是基于它们的发育遗传程序。
在胚胎背端脑的皮质发育过程中，沿着神经前体细胞的进展，放射状胶质前体细胞（RGs）直接或间接通过中间前体细胞（IPs）产生PyNs（图5a，b）。
转录因子的时间性表达为顺序性的发育决定提供了条件，以形成分层组织的PyN亚群。LIM-homeodomain蛋白LHX2和锌指转录因子FEZF2在神经发生的多个阶段发挥作用55,57，而IPs在间接神经发生期间特异性地表达T-box转录因子Tbr258。
我们产生了时间上可诱导的Lhx2-CreER、Fezf2-CreER、Tbr2-CreER、Fezf2-Flp和Tbr2-FlpER（图5c），忠实地再现了这些转录因子的时空表达，并使相关RG和IP细胞的命运图谱化。
我们还产生了15个针对PyN亚群的Cre和Flp驱动，包括CT、PT和IT亚类，以及这些亚类中的亚群（图5b，c），进一步开发了一种组合方法，根据PyN亚型的来源、出生顺序和解剖学特征来锁定它们。
图5：靶向大脑皮层谷氨酸投射神经元类型的遗传工具
MOp输入-输出连接图
通过将经典示踪剂、Cre中的基因病毒标记和单神经元重建与高分辨率、全脑成像、精确的三维图像到CCF和计算分析相结合，产生了一个全面的细胞分辨率输入-输出MOp线路图44。
我们首先使用经典的前向（Phaseolus vulgaris leucoagglutinin (PHAL)）和后向（cholera toxin b (CTb)）追踪（图6a）系统地描述了MOp上肢（MOp-ul）区域的全身输入和输出。
病毒示踪剂被用来系统地检查MOp-ul细胞亚类特异性输入和输出（扩展数据图4b）。使用跨突触狂犬病病毒示踪剂对投射到Cre定义的启动细胞的神经元进行标记。将AAV-GFP注射到野生型小鼠体内后，对来自MOp的投影进行标记，显示出与PHAL追踪一致的模式（图6a）。
我们通过结合稀疏标记、高分辨率全脑成像、完整的轴突重建和定量分析，再加上Janelia Mouselight项目公开的单细胞重建，系统地描述了300多个单一MOp兴奋性神经元的轴突投影。
此外，还使用BARseq进行了额外的分析。该分析显示，在IT、ET和CT亚类中，有丰富的投射模式多样性（图6b）。
图6：MOp-ul神经元类型的全局布线图和解剖学特征
MOp中L4 IT神经元的多模态特征
传统上，MOp被认为是一个无颗粒的皮质区，颗粒层通常为第四层，含有刺状的星状或星状的兴奋性神经元。然而，以前的研究表明，在小鼠MOp和猕猴M1也存在类似于通常在感觉皮质区发现的L4神经元。在此，我们提出了多模式的证据，以证实小鼠MOp和灵长类M1中存在L4类神经元（图7）。
我们对11个小鼠分子数据集的所有IT神经元（不包括高度不同的L6 IT Car3细胞）进行了联合聚类，联合聚类使每个单独模式独立剖析的细胞得以联系起来，并使这些不同的属性交叉相关。因此，我们确定了与集群特定标记基因相关的表观基因组峰--L2/3 IT和L4/5 IT（1）的Cux2，L4/5 IT（1）的Rspo1，L4/5 IT（2-3）的Htr2c，以及L4/5 IT和L5 IT的Rorb（图7b，集群名称来自SCF）。
MERFISH数据显示，L4/5 IT和L5 IT细胞在MOp中占据不同的层，L4/5 IT类型表达Rspo1（图7c），这是以前研究中确定的感觉皮质区的L4细胞类型标记。MOp中Rspo1+的L4细胞比邻近的SSp少。
小鼠的转录组IT类型与人类和狨猴的转录组IT类型在亚类水平上有很好的对应，而在群组水平上存在大量的模糊性（图7d），可能是由于啮齿动物和灵长类动物之间的基因表达变化（图1）。
在对小鼠MOp和小鼠初级视觉皮层（VISp）9的所有SMART-seq谷氨酸转录组进行共同聚类后，我们进一步比较了小鼠MOp的L4细胞（图7e）。MOp中的L4 IT细胞也表现出传统定义的L4兴奋性神经元的形态学特征。
在Patch-seq中，来自L4/5 IT_1型的细胞没有或只有极少的顶端树突，而来自L2/3 IT、L4/5 IT_2和L5 IT型的细胞则有簇状的顶端树突（图7f）。
图7：MOp的L4层存在兴奋性神经元
MOp中L5 ET神经元的多模态特征
以前的研究表明，在小鼠ALM中，L5 ET神经元有两种转录组上不同的投射类型，可能参与不同的运动控制功能：运动计划中的TH投射型和运动启动中的MY投射型。这里我们证明小鼠MOp中的L5 ET神经元也有MY投射型和非MY投射型，在人类和狨猴中具有不同的基因标记、表观基因组元件、层状分布、遗传靶向工具和对应的类型。
与以前的VISp-ALM转录组分类法9相比，小鼠MOp L5 ET_1型对应于ALM MY投射型，而MOp L5 ET_2-4型对应于ALM TH投射型。这里我们表明，这种区分在所有的分子数据集中是一致的（图8a）。
L5 ET_1或L5 ET_2-4型分别与SCF的L5 ET（1）或L5 ET（2-3）型和MERFISH群的L5_ET_5或L5_ET_1-4型以及人类和狨猴的不同L5 ET型对应。MERFISH显示了这两组的层状分布，L5_ET_1-4细胞混合在L5的上部，L5_ET_5细胞明显位于L5下部（图8b）。
这两组细胞通过与特定标记基因相关的表观基因组峰值进一步区分，Slco2a1代表SCF L5 ET（1）型，Npnt代表SCF L5 ET（2-3）型（图8c）。在Epi-retro-seq，形态学以及基因编辑中也可以得到类似的结论。
图8：MOp中两种不同的L5 ET投影神经元类型
MOp细胞类型的整合性分析
作为BICCN这一系列研究的结论，我们提出了小鼠、非人灵长类和人类初级运动皮层中细胞类型的多模态普查和图谱的概述（图9）。
该综合报告使用小鼠MOp共识转录组分类法（图9a）该分类法有一个层次结构，首先是神经和非神经细胞类型之间的主要划分，然后是神经分支内的神经细胞和非神经细胞类型之间的划分，最后是神经分支内的GABA能和谷氨酸能类型的划分。
对应矩阵显示，基于MERFISH的小鼠空间转录组分类法、使用SCF或LIGER37的转录组-外基因组综合小鼠分子分类法以及人类和狨猴转录组分类法都与小鼠共识转录组分类法基本一致。这些排列在亚类水平上高度一致，但在个体簇水平上存在分歧，并随着跨物种的比较而增加。
通过Patch-seq42、Epi-retro-seq45和轴突投射图等综合方法，我们将许多T型或亚类与传统上由电生理、形态和连接特性定义的皮质神经元类型联系起来（图9a，b，f），从而将细胞类型分类学与历史知识联系起来。
最后，我们通过在联合的转录组和表观基因组数据集中发现候选CREs（cCREs）和特定于神经元亚类的主转录因子（图9c），证明了阐释基因调控机制的潜力。同样，我们发现转录因子显示出细胞类型的特异性，并得到RNA表达和DNA结合图案在细胞亚类中富集的支持。
图9：MOp细胞类型的多模态普查和图谱
参考文献
BRAIN Initiative Cell Census Network (BICCN). A multimodal cell census and atlas of the mammalian primary motor cortex. Nature. 2021 Oct;598(7879):86-102. doi: 10.1038/s41586-021-03950-0. Epub 2021 Oct 6. PMID: 34616075; PMCID: PMC8494634.
编译作者：喵喵（brainnews创作团队）
校审：Simon（brainnews编辑部）
国产成像技术fMOST大放异彩！
在Nature 在同一期发布的“大脑皮层运动神经元图谱以及数据库联盟BICCN（BRAIN Initiative Cell Census Network）”的系列论文中，有4篇文章运用了fMOST（fluorescence Micro-Optical Sectioning Tomography）技术绘制完整神经元形态，参与“小鼠全脑细胞图谱绘制“重大项目。
特别需要指出的是，Methods and Tools 部分将华中科技大学骆清铭院士团队2021年3月发表于Nature Methods的fMOST新一代技术“用线照明调制显微术实现高清成像(High-definition imaging using line-illumination modulation microscopy）”1，作为Methods and Tools部分中唯一的光学成像技术。（详见： 文献解读|骆清铭院士团队持续升级fMOST成像技术）。
（Nature杂志官网截图）
此外，Allen脑研究所10月12日在Neuroscience at the Allen Institute发布关于10月6日发表于Nature的超过1700个小鼠全脑完整神经元三维追踪新技术的新闻，指出fMOST技术使得研究者能对小鼠进行全脑完整神经元形态成像2
(Neuroscience at the Allen Institute新闻宣传截图)
由华中科技大学骆清铭院士团队研发并持续迭代更新的荧光显微光学切片断层成像 (fMOST) 技术，是目前为止世界上唯一能够实用化地实现全脑尺度介观分辨率绘制脑图谱的成像技术，极大地推动了脑介观连接图谱的绘制，国内外诸多脑科学研究均依赖于fMOST技术实现全脑尺度单细胞水平的脑图谱绘制。下面详细为大家分享fMOST技术如何助力上述4篇Nature文章，完成小鼠全脑细胞图谱的绘制工作。
多技术协作建立神经元类型标准框架
01
来自于BICCN
首先，BICCN在这篇文章中系统性地描绘了他们的工作——建立一个能够整合多层分子空间遗传信息与多方面表型性质的标准化神经元分型框架3。其主要工作是将转录组学信息、表观基因分析、形态学研究整合在一起，以全方位揭示神经环路与转录组细胞类型的联系。
（初级运动皮层细胞类型综合特征的部分截图）
如上图所示，利用包括fMOST在内的解剖学技术，BICCN配合分子、遗传、生理等领域的多方面技术手段来对三类哺乳动物物种的初级运动皮质（primary motor cortex, MOp）中的神经元进行全面的定性分析。各种技术手段所产生的数据集被整合，形成一个多模式且跨物种的MOp全区域细胞种类详细说明。
特定区域胞体空间分布描绘
02
Hong-Wei Dong团队与fMOST团队等多团队协作，对小鼠MOp中的upper limb 区域（MOp-ul）进行三维重构4。通过示踪确定了超过24个MOp-ul 投射神经元（PN）种类，系统性地绘制了输入-输出通路。
(神经元完整形态重构及其投射模式差异性)
不管是形态学分析还是投射模式的分类，都十分依赖完整的单细胞级别三维重构。本文通过fMOST技术重构了140个投射神经元，加上原有数据，累计获得303个完整形态的单神经元。如上图①所示，根据胞体位置（L2-6，图②）和投射模式（IT/ET/CT，图③），对303个神经元胞体空间分布进行分类，其中有113个存在于为最新界定的MOp-ul范围之内（图①紫色区域）。图②中，借助碘化丙啶（PI）在fMOST成像中对胞体实时复染，全脑内任意冠状面切片都能显示出胞体构筑信息，为神经元空间定位提供强有力的参考。
基于单神经元级别的投射模式研究
03
准确的划分神经元类型，需要整合形态学与分子等各方面信息，并探究不同方面信息的关联性。转录组层面上，其系统性分类可以依赖单细胞RNA测序（scRNA-seq）；但形态学层面上，尤其是对于主要投射模式，如何依赖单细胞级别的成像技术对全脑范围内系统性的分类，仍面临巨大挑战。
Hongkui Zeng团队与fMOST团队等多团队协作，结合稀疏标记、全脑成像、三维重构、配准和分析，在小鼠脑中重建了1741个神经元，生成了目前世界上数目最大的小鼠单细胞神经元数据集5
（11种投射类型的单细胞完整形态代表图）
为了探究长程投射神经元形态多样性的原因，研究团队系统性地分析了8个不同的转录组类别神经元。凭借fMOST技术所提供的全脑范围内单神经元成像，研究团队在皮层（信号汇集）、屏状核（意识开关）、丘脑（感觉高级中枢）、纹状体（协调控制）等脑区中鉴定了11种神经元投射类型。
（投射神经元类型、神经元类型、投射特征的汇总）
随后，这11种投射类型与对应的8种转录组类型相结合，如上表所示。为了更清晰地阐述形态学与分子间的联系，研究团队还将形态学特征分成了多个层面的信息，包括投射类别、投射模式（汇聚或发散）、平均投射区域数量等。归纳这些信息后发现，部分拥有同样转录组信息的神经元，但在形态学上却有巨大的差异。
多脑区网络建立
04
单神经元完整形态的重构不仅仅是为了神经元分型归类，同时还利于绘制局部环路和全脑网络。皮质-基底核-丘脑网络，作为最基本的网络结构之一，其结构的揭示对认知研究、感觉运动行为研究、神经精神疾病起源探索有重大启示作用。
Hong-Wei Dong团队与fMOST团队等多团队协作工作，绘制了纹状体区域的输出通路，投射经过了苍白球外侧（GPe）、黑质网状部分（SNr）、丘脑和皮层；并鉴定了6个平行的皮质-基底核-丘脑环路6。
(fMOST成像结果)
fMOST技术不仅能验证投射到目标区域，还能显示出末梢所处目标区域的一个精准分布。如上图所示，单个的纹状体神经元投射分布整个SNr的额状轴。7只小鼠中共计30个纹状体神经元通过fMOST成像完整重构出来。
（fMOST结果展示的神经元投射图）
直接与间接的信号通路在纹状体中混合并存，如何区分并确定信号传导机制？通过fMOST全脑范围内单神经元级别三维成像，配合分割好的GPe三维脑区，能清晰地分辨出投射经过或是终止于GPe，从而更方便判定间接和直接的信号通路并分析他们形态学差异。
参考文献
1、Zhong, Q. et al. High-definition imaging using line-illumination modulation microscopy. Nat Methods 18, 309-315, doi:10.1038/s41592-021-01074-x (2021).2、Yanny, A. M. Now in stunning, whole-brain resolution: neurons. Neuroscience at the Allen Institute, https://alleninstitute.org/what-we-do/brain-science/news-press/articles/now-stunning-whole-brain-resolution-neurons ( 2021).3、Network, B. I. C. C. A multimodal cell census and atlas of the mammalian primary motor cortex. Nature 598, 86-102, doi:10.1038/s41586-021-03950-0 (2021).4、Munoz-Castaneda, R. et al. Cellular anatomy of the mouse primary motor cortex. Nature 598, 159-166, doi:10.1038/s41586-021-03970-w (2021).5、Peng, H. et al. Morphological diversity of single neurons in molecularly defined cell types. Nature 598, 174-181, doi:10.1038/s41586-021-03941-1 (2021).6、Foster.N.N.etal The mouse cortico-basal ganglia-thalamic network. Nature598 188-194,doi:10.1038/s41586-021-03993-3 (2021).关于沃亿
公司基于显微光学切片断层成像（MOST)技术的系列仪器设备，在国际上率先建立了可对厘米大小样本进行突起水平精细结构三维成像，填补了核磁共振成像和电子显微镜之间的空白。该技术获得2011年度中国科学十大进展，2014年获得国家技术发明二等奖,2019年参加中华人民共和国成立70周年大型成就展。