Ageing Res Rev：血小板活化可导致血浆Aβ水平升高而导致AD?
撰稿：杜海亮 李岩松
编辑：刘 畅
来源：西交大一附院麻醉手术部
1、阿尔茨海默病的淀粉样蛋白级联假说
淀粉样蛋白级联假说是目前公认的AD发病机制假说。APP在成熟和加工过程中由α-、β-和γ-分泌酶程序性剪切。β-分泌酶裂解生成可溶性APPβ(sAPPβ) N端和C99C端片段。然后，C99的c端片段被γ分泌酶切割，从而产生不同长度的Aβ多肽。在非淀粉样变途径中，APP被α分泌酶在Aβ区域的16(Lys)和17(Leu)氨基酸之间切割。α分泌酶的作用不仅阻止aβ多肽的形成，而且还诱导大的APP外结构域和一个被称为C83的膜栓细胞内c端片段从细胞表面释放。Aβ多肽的大小可能不同(从38到43个氨基酸)，因为γ分泌酶的切割有点不精确。有两种主要的亚型:Aβ40由40个氨基酸组成，是大脑和内皮斑块中最丰富的亚型(80- 90%)，而42个氨基酸的亚型Aβ42较少(5-10%)。Aβ42具有较强的疏水性和致病性;它可以聚集成低聚物，然后形成原纤维，原纤维与其他物质聚集在一起，最终形成细胞外斑块和沉积在大脑中的主要种类。APP、PS1或PS2基因突变的存在可以提高大脑Aβ水平，从而增加淀粉样蛋白沉积和AD的风险。2、血管功能障碍与阿尔茨海默病
流行病学、神经影像学、病理学和临床研究积累的证据表明，血管危险因素（动脉高血压、2型糖尿病、高脂血症、高胆固醇血症）和血管病理学（动脉硬化性微血管病和淀粉样血管病）可能在AD的发病和进展中起关键作用。事实上，超过95%的AD患者患有脑淀粉样血管病（CAA）其中，Aβ沉积在大脑动脉和毛细血管壁上。CAA可能导致神经退行性变和认知能力下降。CAA的发病率随着年龄的增长而增加，通常与载脂蛋白Eε4等位基因（APOE-ε4）的存在和载脂蛋白E4的表达增加有关。载脂蛋白E4是参与脂质代谢的一种载脂蛋白亚型，与动脉粥样硬化有关，是散发性AD的主要已知遗传危险因素。
编码淀粉样前体蛋白（APP）、早老素1（PS1）或早老素2（PS2）的基因存在常染色体显性突变的AD受试者经常出现CAA病理。在CAA中，脑血管往往表现为血管平滑肌细胞（SMC）缺失、管腔狭窄、血管壁增厚、微动脉瘤形成和脑内微出血。血管风险管理，包括降低脑梗死风险的预防和治疗，可能降低痴呆症（包括AD）的患病率和进展率。在芬兰和台湾进行的两项大型队列研究发现AD患者发生中风风险增高1.3-1.7倍。免疫组织化学研究已证明晚期动脉粥样硬化斑块中存在APP和Aβ，一些作者甚至认为AD是一种血栓出血性疾病。
3、血浆β-淀粉样蛋白与阿尔茨海默病的病理生理学
对认知健康受试者的纵向研究表明，高的基础血浆Aβ42水平与未来AD风险增加相关。低血清Aβ-白蛋白复合物也与脑脊液Aβ42水平降低相关，脑脊液磷酸化tau水平升高和AD患病率升高相关。这些观察结果表明，随着年龄的增长，血清白蛋白结合Aβ的能力降低，可能会减缓Aβ从中枢神经系统的清除，并增加大脑的炎症反应。从血液中去除毒性和衰老因子，同时补充“恢复活力”元素，可能对防治衰老和AD的有利的假说已经在动物身上得到了广泛的验证。血液交换的动物模型使用了异时联体共生模式，这是一种将两种不同年龄动物的器官和循环系统连接在一起的外科手术，以证明其有益效果。该方法已被证明可刺激老年小鼠海马的神经发生和突触可塑性，并改善认知功能。这些变化与增加的cAMP反应元件结合蛋白（CREB）信号有关，CREB信号与突触可塑性有关。此外，年轻动物暴露于老化血液中导致海马齿状回神经发生显著减少，其影响由C-C基序趋化因子11（CCL-11）水平升高介导。相反，转基因AD和野生型小鼠之间的联体共生可导致野生型小鼠Aβ在血管壁和实质中的沉积增加并且在大脑中形成AD样蛋白聚集体，这表明血源性Aβ可以进入中枢神经系统，从而增加退行性变。
血液中循环的绝大多数Aβ（约90%）以1:1的比例与白蛋白结合，体外研究表明人类白蛋白制剂能够与Aβ肽结合。Grifols（西班牙巴塞罗那）正在开发用富含人白蛋白（Albutein®）的人血浆（含或不含人免疫球蛋白（FlebogammaDIF®））治疗AD的血浆置换疗法。使用治疗性血浆置换（TPE）的理论性依据是在AD患者中，Aβ在脑内的异常积聚是AD过程中的一个中心病理事件。大脑和血浆aβ水平之间存在动态平衡，TPE可以清除大脑中过量的aβ并提供临床益处。最初的研究试图验证TPE是否能改变血浆和脑脊液中Aβ的浓度。一项2b/3期研究检查了347例轻中度AD患者的TPE效果。将三个不同剂量白蛋白和静脉注射免疫球蛋白替代物的TPE治疗组与安慰剂进行比较（假手术）。TPE治疗组患者在共同主要终点方面的表现明显优于安慰剂组：与第14个月阿尔茨海默病合作研究日常生活活动量表（ADCS-ADL；P=0.03；下降减少52%）基线相比的变化。TPE治疗的患者在临床痴呆症评分总和（CDR-SB）（P=0.002；下降减少71%）和阿尔茨海默病临床总体印象变化量表（ADCS-CGIC）（P<0.0001；下降减少100%）方面得分更好。含有假定有益蛋白质的血浆成分的临床试验也在进行中。
4、血小板与外周血Aβ水平有关吗
Aβ假说假设Aβ的产生和清除之间的不平衡是AD的始动因素。然而，脑成像和组织病理学研究表明，认知正常个体的大脑中也经常存在Aβ斑块，斑块负荷与认知能力之间的相关性较差，神经元死亡也发生在没有斑块的大脑区域。最新的观点是，Aβ低聚物浓度的增加会引发神经元功能障碍和网络改变，由聚集在缠结中的高磷酸化tau蛋白产生继发性损伤。
最近，另一种理论假设β-淀粉样变可能起源于从血液扩散到大脑的Aβ多肽，与其他常见形式的淀粉样变一样，如轻链免疫球蛋白淀粉样变、跨甲状腺淀粉样变或反应性系统性淀粉样变。
血小板是人类血液中Aβ多肽的主要来源（90%）。认知正常受试者血浆中的游离Aβ40和Aβ42浓度分别约为150pg/mL和30pg/mL。AD患者的平均血浆Aβ40水平略高于对照组，而Aβ42水平在两组之间相似，因此AD受试者的Aβ42/Aβ40血浆比率通常低于对照组。
血小板是来源于巨核细胞的小无核细胞，呈现神经元样APP处理系统。与主要通过β-分泌酶途径处理APP的神经元不同，血小板主要通过α-分泌酶处理APP。在神经元中，β-分泌酶活性主要在细胞质中表达，而γ-分泌酶的裂解发生在APP的跨膜结构域内（构造性分泌途径）。血小板似乎通过所谓的调节分泌囊泡途径处理APP并释放Aβ肽，在该途径中，多肽主动转运至特定的亚细胞域，以响应特定的细胞外信号进行细胞外转运。血小板具有不同类型的颗粒：α-颗粒、致密颗粒和溶酶体。α-颗粒既包含具有羧基末端表位的可沉淀全长APP，也包含缺乏羧基末端表位的可溶性APP（仍然包含Aβ）可溶性形式为sAPPα、sAPPβ和Aβ片段。APP的可溶性形式主要为sAPPα，约占APP总量的90%。全长可溶性APP具有可在溶液中直接进行蛋白水解切割的β-和γ-分泌酶位点。
最近，有人提出，特化的组织蛋白酶B酶可能在这一途径中发挥着非常重要的作用，作为一种强大的β分泌酶，产生大部分分泌的细胞外aβ肽。组织蛋白酶B酶是一组蛋白水解酶，其半胱氨酸或硫醇基团参与裂解底物。其抑制导致aβ生成减少。
这一途径似乎与血小板活化状态密切相关。它对生理或非生理激动剂如凝血酶、胶原和离子霉素有反应。激动剂处理的血小板分泌所有分子中约50%是APP。一旦分泌途径被激活，脱粒开始，APP及其所有衍生物被释放。分泌的内容物可能被血小板颗粒膜的残余物包裹，构成专门的脂质小泡（内含体），向细胞膜的细胞质侧移动，似乎通过与外体相关或以外体形式的脂质通道蛇形系统从血小板中挤出，微泡或微粒。此外，研究表明，主要由组织蛋白酶B进行的β-裂解发生在“早期”内含体中。因此，APP一旦释放，也可以被内皮细胞切割，正如Davies在1998年的一项开创性研究中所显示的那样。
考虑到血小板产生大部分APP和Aβ片段，因此可以假设任何影响该通路的异常都可能导致外周血水平升高，并且在血脑屏障（BBB）功能受损的特定条件下，导致Aβ沉积在脑实质中。
血小板在动脉粥样硬化过程和心血管事件的发展中起着关键作用。因此，我们可以推测，导致假设的Aβ浓度增加的血小板变化可能会导致血小板对血管的粘附和聚集的改变。鉴于大量研究描述了AD患者血小板功能的改变，似乎很容易假设血小板的改变可能在血管危险因素/动脉粥样硬化和AD之间提供了额外的联系。
5、有证据表明AD患者血小板活化吗?
已经充分证明，在正常和病理性衰老中，血小板表现出更大的聚集性，在病理状态中更明显。这种更大的聚集性可能是血小板反应性更高的表现。与年轻人相比，老年受试者出血时间缩短，对激动剂如二磷酸腺苷（ADP）、肾上腺素、胶原蛋白和花生四烯酸的促聚集作用更敏感。研究发现，血小板反应亢进每10岁增加约8%，女性比男性更明显。β-血栓球蛋白(β-TG)、p-选择素(CD-62)和血小板因子4(PF4)是储藏在α颗粒中的蛋白，在血小板激活时释放，可作为可靠的血小板激活指标。老年人血浆中这些蛋白的浓度明显高于年轻人。老年血小板过度活化可能是血管和血栓性疾病风险增加的原因。然而，衰老过程中血小板过度活跃的分子机制目前尚不完全清楚。已经有人提出了与衰老过程相关的磷酸肌肽转换的改变，或肾上腺素能途径的改变，或过度的氧化应激。其他研究表明，与老年对照组相比，AD患者血小板中aβ多肽对血小板线粒体膜电位具有特异性作用且反应异常。这些研究表明血小板活性增加、线粒体功能障碍和AD之间存在联系。有趣的是，人类血小板计数在60岁左右时通常是稳定的，然后下降约8%，可能是对血小板反应性增加的补偿。
与年龄匹配的对照组相比，AD受试者的血小板计数相似，但根据p-选择素表面表达、血小板聚集和血小板-白细胞复合物的估计，显示出较高的血小板活化状态。由于血小板是人类血液中APP和Aβ肽的主要来源，并且在AD中是血小板APP处理异常的，因此推测血小板活化可能参与AD的病理生理过程。
一项横断面研究发现，与对照组相比，AD患者体内血小板活化（11-dehydro-TXB-2）和脂质过氧化（8-iso-prostaglandin(PG)F2α）的尿标记物显著高于对照组，尿代谢物和维生素E之间呈负相关。这些发现表明，AD患者血小板活化持续增强，可能与维生素E水平不足导致的脂质过氧化增加有关。有趣的是，阿司匹林（而非罗非昔布）治疗显著降低了尿中11-dehydro-TXB-2水平，表明COX-1参与TXA2生物合成。一项为期1年的随访研究发现，与认知能力缓慢下降的AD患者相比，认知能力快速下降的AD患者两种血小板活化生物标记物（活化糖蛋白IIbIIIa复合物和P-选择素）的基线表达更高。一项针对轻度认知障碍（MCI）受试者的研究发现，遗忘症患者的包被血小板（胶原蛋白和凝血酶共同激活产生的血小板子集）水平明显高于非记忆症患者。包被血小板也与MCI的演变相关，在遗忘性MCI中更为严格地与完全性AD相关。在一项横断面研究中，在AD受试者中，包被血小板水平与疾病严重程度呈负相关。一项对AD患者进行的为期两年的纵向研究发现，最严重的认知能力下降发生在初始包被血小板生成量最高的个体。与AD相比，额颞叶痴呆（FTD）患者的疾病严重程度与包被血小板水平之间没有显著关系。
如前所述，血小板是APP的重要外周来源，因为已经证明由770、751和695个氨基酸残基组成的三种主要亚型插入静止血小板的膜中。APP751和APP770亚型包含Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂结构域（APPKPI），而APP695缺少该结构域。研究使用实时定量PCR检测血小板APP亚型mRNA。与对照组相比，AD患者组的基因表达测量显示APPTOT（1.52倍）、APPKPI（1.32倍）、APP770（1.33倍）和APP751（1.26倍）显著上调。此外，APPmRNA水平（TOT、KPI、770和751）与认知障碍之间存在显著的正相关。这些发现在另一项研究中得到了验证，该研究将AD患者与额颞叶痴呆（FTLD）和对照组进行了比较。他们发现，与对照组相比，AD和FTLD患者的APPTOT和APPKPI显著上调，尽管认知能力下降的严重程度与FTLD患者的上调表达无关。所有这些发现表明，AD患者的血小板含有更多APP，这是Aβ的潜在来源，并且这种升高可能是神经退行性疾病中AD特有的。另一项研究提供了AD患者血小板过度激活状态的进一步证据，证明这些过度激活的血小板在损伤健康血管方面更具攻击性。对表达APP、PS1和tau（3xTgAD）人类突变体的转基因小鼠的形态和功能的研究表明，AD突变导致循环血小板显著的高激活状态，这一点随着疾病的进展而更加明显。
在血栓形成过程中，血小板聚集在血块中并被激活。在血栓形成的小鼠模型中进行的一项研究检测到血栓形成部位血小板大量释放Aβ。据推测，在AD患者中观察到的凝血异常是由于APP对凝血参数的干扰作用所致。事实上，血小板减少在AD患者中极为罕见。在20591份关于AD病例的FDA报告中，只有0.4%出现血小板减少，在长期使用某些药物后出现在疾病的晚期。有趣的是，血小板减少动物在凝血过程中产生较低水平的Aβ肽。
相反，两项研究发现，与年龄匹配的对照组相比，AD受试者血浆和脑脊液中的β-血栓球蛋白（β-TG）和可溶性糖蛋白V（sGPV）水平降低，后者是血管性血友病因子和凝血酶的血小板糖蛋白Ib-IX-V（GPIb-IX-V）受体的一个亚单位。然而，我们应该强调的是，样本的数量和性别并不匹配。另一项研究发现，AD患者的血小板活化程度较低，这表明散发性AD的特点是血小板密度较低，在循环过程中，反应性降低。在另一项研究中，在血小板激动剂凝血酶受体激活肽（TRAP-6）刺激下，AD受试者的血小板与对照血小板相比反应性较低。这一发现被解释为持续激活后血小板衰竭的迹象，反映在可溶性p-选择素血浆水平的增加。
6、血小板活化是否导致Aβ血浆水平升高？
当神经元产生大量的Aβ42肽时，血小板主要产生Aβ40并在激活时释放，从而产生血液循环中大部分（90%）的Aβ。
在表达编码早老素2（一种负责通过蛋白质水解产生aβ的γ-分泌酶活性成分）的PSEN2基因突变形式的AD转基因小鼠模型中进行的一项有趣的研究表明，aβ肽的外周减少足以减少脑aβ沉积。服用STI571（一种不穿过BBB的癌症治疗药物）可减少血液和大脑中aβ的积累。
7、从外围到大脑
一些研究表明，AD患者的血小板可能更容易激活，从而向血液中释放aβ。血小板似乎能够自行触发淀粉样级联反应，随着时间的推移，淀粉样级联反应可导致aβ在脑实质中进行性沉积。循环Aβ可结合血小板上三种可能的受体，如蛋白酶激活受体-1（PAR1）、糖蛋白IIb/IIIa（GPIIb/IIIa）和晚期糖基化终产物受体（RAGE）。这种结合可以激活多种信号通路，并诱导血小板细胞内Ca2+浓度增加，从而刺激α颗粒和致密颗粒的分泌。Aβ40肽与这些血小板受体的结合引发了血小板活化和Aβ40过度产生的恶性循环。一旦穿过BBB，Aβ可刺激血小板中的整合素受体，导致ADP和聚集蛋白（载脂蛋白J）的释放，从而促进Aβ低聚物、纤维状Aβ聚集体以及最终老年斑的形成。Aβ聚集体和斑块触发星形胶质细胞和小胶质细胞介导的炎症反应过程。胶质细胞通过募集巨噬细胞和中性粒细胞激活全身免疫反应，产生细胞因子、白细胞介素和TNF-α，最终可能导致不可逆转的神经元损伤。同时，tau蛋白在神经元内经历异常磷酸化，并逐渐累积形成神经原纤维缠结。胆碱能神经元尤其受到这一病理过程的影响，尤其是皮质、皮质下区以及海马区。
Bu等人于2018年利用APPswe/PS1dE9转基因小鼠与其野生型同窝小鼠之间的联体共生模型复制了这一假设的病理生理过程。他们观察到，在这种转基因AD模型小鼠中表达的人类Aβ进入循环，并在野生型小鼠的大脑中积累，因此在12个月的联体共生后形成脑淀粉样血管病和Aβ斑块。在野生型联体共生小鼠的大脑中发现了与Aβ积累相关的AD型病理学，包括tau过度磷酸化、神经退行性变、神经炎症和微出血。更重要的是，野生型联体共生小鼠海马CA1长时程增强显著受损。因此，可以假设，作为第一步，由于对某些未知的败血症或无菌原因的反应，发生血小板聚集。血小板衍生的Aβ可能通过载脂蛋白结合机制穿过BBB。受体高级糖基化终产物受体（RAGE）、低密度脂蛋白受体相关蛋白1（LRP1）、P-糖蛋白（也称为ABCB1）和乳腺癌耐药蛋白（也称为ABCG2）参与Aβ进出大脑的转运。使用碘化标记的Aβ对老龄猴子进行的研究表明，循环Aβ通过BBB的转运有助于淀粉样蛋白的脑实质积累。一个生理相关的3D人类神经细胞培养微流控模型表明了在AD患者中观察到的BBB功能障碍的几个关键方面：BBB通透性增加，claudin-1、claudin-5和VE钙粘蛋白的表达降低，基质金属蛋白酶-2和活性氧物种的表达增加，Aβ多肽在血管内皮沉积。
脑源性和血源性Aβ都可以压垮生理清除系统的能力。考虑到RAGE表达是由其配体水平决定的，这一点也很重要。因此，阻断其与Aβ的相互作用被认为是一个治疗靶点，并且该途径在血小板中的重要性与此相关。这一假说与最近发现的类淋巴系统有关，该系统提出了血管周围清除Aβ而不返回血液的替代途径。个别情况，如载脂蛋白E等位基因ε4的携带者，可能会影响脑内皮细胞的细胞膜完整性，形成一个紧密连接系统来调节大脑和循环血液因子之间的通讯，可能影响大脑和血管系统，有利于AD、心血管疾病或中风的发病。
8、抗血小板药物在阿尔茨海默病中的临床研究
在AD中很少进行抗血小板药物的试验。研究最多的药物是阿司匹林，它在低剂量（75-100mg/天）下进行了试验，保留了抗血小板特性，但产生的胃肠道效应比高剂量要少，尽管几乎没有抗炎作用。阿司匹林可抑制人血小板淀粉样前体蛋白的分泌。在一项对缺血性血管性痴呆患者的回顾性研究中，低剂量阿司匹林增加了患者的生存率和住院治疗时间，并已证明对预防中风和血管疾病有益处。首次对310名社区居民AD患者（156名服用阿司匹林，154名不服用阿司匹林）进行低剂量（75mg/天）肠溶阿司匹林的3年开放性试验，未显示该药物对认知（通过简易精神状态检查[MMSE]评估）和功能有任何益处（使用布里斯托尔日常生活活动量表[BADLS]进行评估）。最近的一项长期、双盲、安慰剂对照试验（ASPREE）对低剂量阿司匹林（100mg/天）与安慰剂治疗老年人突发性全因性痴呆、突发性AD、轻度认知障碍（MCI）和认知下降也呈阴性。总共对19114名参与者进行了为期中位数4.7年的随访。所有痴呆触发因素的风险（危险比[HR]，1.03；95%可信区间[CI]，0.91–1.17）、可能的AD（HR，0.96；95%可信区间，0.74–1.24）或MCI（HR，1.12；95%可信区间，0.92–1.37）阿司匹林组和安慰剂组之间没有实质性差异。阿司匹林组和安慰剂组随着时间的推移认知变化相似。
很少有其他抗血小板药物在AD患者中进行临床试验。西洛他唑（100mg/天）是一种抗血小板药物，环磷酸腺苷磷酸二酯酶3抑制剂，在20例老年AD和脑血管疾病患者中，对照组(阿司匹林100mg或氯吡格雷50mg - 75 mg/天)的认知功能下降(根据阿尔茨海默氏病评估量表-认知亚量表测量)，但西洛他唑没有显示出统计学意义上的认知功能下降。另一项西洛他唑（100mg/天）的12个月小规模开放性试验在30名AD患者和30名未经治疗的对照组中进行，抗血小板药物对MMSE和CDR-SB均有显著疗效。西洛他唑对166名MCI患者的96周双盲安慰剂对照研究于2020年完成，但结果尚未公布。
这些研究表明，低剂量阿司匹林对治疗或预防AD无效。这些发现与流行病学研究相反，流行病学研究表明阿司匹林可以预防AD发作。然而，共发病和阿司匹林剂量可能至关重要。小剂量阿司匹林的一个主要适应症是预防中风和短暂性脑缺血发作，可能掩盖药物抗痴呆作用。或者，如果保护作用是由于抗炎机制，低剂量阿司匹林可能不够。一项横向和纵向研究评估了高剂量（>500mg/天）还是低剂量（75mg/天）阿司匹林可以在702名80岁或以上的人中预防AD。服用高剂量阿司匹林者的AD患病率明显低于未服用者，认知功能维持较好。数字上相似，但与使用低剂量阿司匹林无显著相关性。这项研究表明，全剂量阿司匹林可能可以预防AD。如果是这样，那就不是因为它的抗血小板活性，而是因为它的抗炎活性。
结 论
我们回顾了强有力的实验和临床证据，表明血小板活性增加可能导致AD痴呆的进展，主要是通过增加血小板自身粘附相关的特异性蛋白的表达来增加血小板聚集，血小板与内皮细胞的粘附和白细胞向血管壁的募集触发血管周围炎症。血小板活化与颈动脉疾病进展相关，导致动脉粥样硬化栓子形成风险增加和脑灌注减少。血小板高反应性会导致APP释放增加，从而导致血浆aβ水平升高，穿过血脑屏障的风险更大，实质沉积的风险更大。因此，血小板活化似乎可以解释AD的病理生理机制，同时激发AD与心血管疾病风险增加之间的密切联系。当然，已经提出了AD发病机制的其他假设（Box1）。其中一些（氧化应激、神经炎症和异常糖代谢）可能共存并导致血小板高反应性。
未来需要进一步的研究来阐明血小板活化对外周血Aβ的影响。如果血小板活化在AD病理生理学中的作用得到证实，新的诊断工具（特异性血小板血液生物标记物、血小板活化的表达产物）可能会被开发出来，新的治疗方法可能会在AD患者中进行测试。这些未来的研究也可能产生重要的见解，以了解精神病理性疾病（特别是属于情感谱系的精神病理性疾病）与神经退行性疾病之间的关系，从而找到新的治疗方法。
原文链接：Ageing Res Rev.2021 Nov;71:101420.
doi: 10.1016/j.arr.2021.101420. Epub 2021 Aug 8.