Neuron：基于LARAT的Opto-vTrap有望在未来开发出新的通用和灵活的光遗传工具！
光遗传探针，如盐视紫红素和原始视紫红素，可通过超极化膜电位间接抑制递质释放抑制大脑活动，但会引起反常的离子不平衡和反弹峰值，并不适用于非兴奋性胶质细胞。
近期，发表在Neuron上题为“Opto-vTrap, an optogenetic trap for reversible inhibition of vesicular release, synaptic transmission, and behavior”的文章。
设计光诱导和可逆抑制系统Opto-vTrap，发现在光伏脑片激活后，急性脑切片的突触和胶质传输显著减少。并提出Opto-vTrap可以最小的干扰效应控制大脑活动和行为。
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1.Opto-vTrap光学基于
LARAT的囊泡捕获系统
LARIAT由响应光的CRY2和它的靶蛋白CIB1组成。Opto-vTrap由过表达载体中两个分子组成，每个分子包含CMV::CIBN-mCherry-VAMP2(CIBN-VAMP2)和CMV::CRY2PHR-mCitrine(CRY2)(图1)。
图1：Opto-vTrap的设计与原理
在COS-7细胞中，0.2Hz和20%占空比的蓝色激光照射下，观察到CIBN-VAMP2和CRY2在5分钟内和整个照明过程中同时聚类，在1~2min内快速恢复，在“刺激断开”后的15min内缓慢恢复(图2)。
图2：COS-7细胞中Opto-vTrap的表征
2.Opto-vTrap损害囊泡分泌
在5HZ、40%占空比的488nm蓝光刺激开始30秒后，加入高钾溶液，其中488nm激光同时激活Opto-vTrap和在全内反射荧光(TIRF)成像下可视化NPY-VENUS，发现Opto-vTrap的光刺激抑制含NPY-VENUS的囊泡的胞外分泌。
另外，通过荧光强度测量每个胞外事件，发现Opto-vTrap的光刺激消除胞吐过程中的峰值荧光强度，Opto-vTrap有效地阻断囊泡的胞吐(图3)。
图3：Opto-vTrap对Neuroscreen-1细胞囊泡分泌的光遗传抑制
3.Opto-vTrap的激活不影响膜电位
构建包含CRY2PR-P2A-CIBB-mBIRCH-VAMP2的慢病毒Opto-vTrap载体，并将慢病毒双侧注射到CA3海马中。记录在急性制备的海马切片中表达OPTO-VTRAP的CA3锥体神经元的膜电位变化后，再测量连续蓝光刺激CA3区域时膜电位的变化。
观察到连续的蓝光照射10分钟没引起任何膜电位变化，表明激活Opto-vTrap不影响膜电位（图4）。
4.激活Opto-vTrap抑制
Schaffer侧支突触中诱发的EPSCs
记录双脉冲电刺激Schaffer侧支突触时，CA1锥体神经元诱发突触后电流(eEPSCs)，发现光照对突触传递没不利影响。与没有光刺激相比，Opto-vTrap显示在“光”作用15分钟后，第一、二次eEPSCs振幅显著降低。
另外，在CK启动子下构建AAV Opto-vTrap，并在Schaffer侧支突触上进行测试，发现Opto-vTrap可有效且可逆地抑制脑回路中神经递质的释放。
即便激活Opto-vTrap，成对脉冲比(PPR)在“亮灯”条件前、期间和之后没显著差异。表明Opto-vTrap抑制囊泡释放可能不会影响突触前残余Ca2+(图4)。
5.激活Opto-vTrap
抑制新皮质星形胶质细胞囊泡胶质递质释放
构建一包含Opto-vTrap, CRY2PHRP2A-CIBB-mCHERRY-VAMP2的慢病毒载体，并将慢病毒注射到新皮层的2/3层，发现三种NMDAR介导的自发瞬时内电流：神经元mEPSC、胶质诱导快速电流(gFICs)、胶质诱导慢电流(gSICs)。
另外，TFLLR的应用没引起mEPSCs频率的变化，而在控制条件下，TFLLR导致gFICs和gSICs频率显著增加。在注射GFAP::Opto-vTrap的小鼠中，发现gFICs由囊泡释放机制介导，而gSICs由非水泡状、通道介导的释放机制介导。最终表明，Opto-vTrap为快速可逆的光遗传抑制工具，用于囊泡胶质传递素的释放(图5)。
图5：激活Opto-vTrap抑制新皮质星形胶质细胞囊泡胶质递质释放
6.Opto-vTrap的激活
可逆地抑制情境恐惧记忆的提取
将CamKIIa::Opto-vTrap慢病毒单侧注入海马CA3区，并在CA1区植入视神经套管进行照明。术后3周，每只注射Opto-vTrap的小鼠在第1天进行环境恐惧条件反射。第2天将每只老鼠置于相同的环境中获得恐惧记忆。作为没光照的对照组，每只老鼠在第3天进行额外的上下文记忆检索测试。
发现通过激活Opto-vTrap可抑制Schaffer侧支通路有效且可逆地损害恐惧记忆恢复。表明Opto-vTrap可用于行为动物，通过快速启动和恢复时间，在空间、时间和细胞类型上特异性地抑制大脑回路和行为(图6)。
图6：Opto-vTrap的激活可逆地抑制情境恐惧记忆的提取
结 论
新开发的Opto-vTrap可用于光诱导的囊泡释放、突触传递、胶质传递和行为的可逆抑制，并在如今成为抑制光基因探针的首选。此外，Opto-vTrap的优点是它的快速恢复时间和它的设计基于LARIAT，利用CIBN和CRY2相互作用进行照明。所以，基于LARAT的Opto-vTrap有望在未来开发出新的通用和灵活的光遗传工具。
参考文献
Won J, Pankratov Y, Jang MW, Kim S, Ju YH, Lee S, Lee SE, Kim A, Park S, Lee CJ, Heo WD. Opto-vTrap, an optogenetic trap for reversible inhibition of vesicular release, synaptic transmission, and behavior. Neuron. 2021 Nov 24:S0896-6273(21)00896-5. doi: 10.1016/j.neuron.2021.11.003. Epub ahead of print. PMID: 34852235.
编译作者：臻至秦（brainnews创作团队）
校审：Simon（brainnews编辑部）