Neuron：谭超等开发小分子蛋白重建突触内活跃区的核心功能

大脑的功能高度依赖于精准调控的突触传递。活跃区（active zone）是控制突触前神经递质分泌的分子机器。活跃区由多个蛋白家族组成，包括 RIM、ELKS、Munc13、RIM-BP、Bassoon/Piccolo 和 Liprin-α（见图1）。这些蛋白质分子量从 120 到 420 kDa 不等，它们之间相互作用形成了复杂的蛋白质网络。活跃区的主要功能是实现囊泡与突触前膜对接（vesicle docking），增加囊泡的融合能力（vesicle priming）以及耦合钙离子引导囊泡融合完成神经递质释放。以往的研究发现，活跃区的蛋白质网络“牵一发而动全身”，即单独敲除任何一个活跃区的蛋白都会引起活跃区功能的缺陷。因此研究者们难以判断哪些蛋白质在活跃区控制递质释放中起核心作用。一种新的研究思路是通过重建活跃区的功能来寻找其核心构成元素，但到目前为止尚未实现。

图1：突触中的活跃区结构示意图

2022 年 2 月 16 日，来自哈佛医学院 Pascal Kaeser实验室的谭超博士和他的同事在Neuron杂志上发表了题为Rebuilding essential active zone functions within a synapse的论文。在本文中，作者在破坏了活跃区蛋白质网络的情况下重新构建了活跃区的功能。

首先，作者通过敲除原代海马神经元中的 RIM 和 ELKS 来破坏活跃区。他们观察到敲除神经元中的 RIM 和 ELKS 会造成活跃区中RIM1、 ELKS2和 Munc13-1 蛋白几乎完全丢失，Bassoon和 RIM-BP2 蛋白大幅度减少，以及 CaV2.1 通道蛋白的部分丢失。此外，敲除神经元中的 RIM 和 ELKS 后，囊泡与突触前膜的对接消失，具有融合能力的囊泡下降了约 70%，并且囊泡与钙离子的耦合严重受损，这些结果表明活跃区蛋白质网络已被破坏。

接下来，作者们开始重建活跃区的功能，首先是通过重新表达 RIM 或 ELKS。作者发现，新表达的ELKS2 蛋白无法定位到活跃区，但新表达的 RIM1 蛋白可以定位到活跃区。并且，新表达的RIM1 蛋白还恢复了活跃区中其他蛋白质的表达水平，这些蛋白质包括 Munc13-1、RIM-BP2、Bassoon 和 CaV2.1，因此 RIM1可能是控制活跃区蛋白网络的关键蛋白。为了阐明活跃区的核心构成元素， 作者希望使用尽量小的蛋白质结构域来重建活跃区的功能，为此，作者构建了多个 RIM1结构域的突变。作者发现，RIM1中单一的锌指结构域（Zn）可以定位到突触前囊泡池。值得注意的是，RIM1中锌指结构域能将 Munc13-1蛋白也募集到突触前囊泡池，并且它们之间的相互作用增加了囊泡的融合能力。但是，囊泡与突触前膜的对接并没有发生改变。这是非常有趣的现象，因为传统观点认为囊泡首先与突触前膜形成对接，然后囊泡的融合能力被提升（见图2，图片出自参考文献2），或者这两个过程同时发生 (参考文献3)。这项研究的结果挑战了传统的“先囊泡对接， 后提升囊泡融合能力”的模型，相反，这项研究表明增加囊泡的融合能力和囊泡与突触前膜对接是分开的过程，这两个过程发生的先后顺序可以改变。

图2：囊泡释放和循环的过程示意图

之后，作者旨在通过将 RIM1锌指结构域靶向 CaV2 通道来恢复囊泡与突触前膜的对接，从而使具有融合能力的囊泡在动作电位诱发的钙离子内流时完成囊泡融合，从而促进神经递质的释放。作者将 RIM1锌指结构域直接与 钙离子通道亚基CaVβ4连接起来， 将其命名为β4-Zn。作者发现，β4-Zn能够定位于活跃区，并且增加了活跃区Munc13-1和CaV2蛋白的表达水平。并且，β4-Zn完全重建了活跃区的功能，包括实现囊泡与突触前膜对接，增加囊泡的融合能力以及耦合钙离子引导囊泡融合。进一步的研究发现，β4-Zn 的功能主要依赖于其对Munc13-1的招募以及其与Munc13-1的结合（见图3），并未招募其他活跃区蛋白，例如Bassoon或RIM-BP2蛋白。

图3: 重建的活跃区示意图

最后，作者在非神经元细胞中用转染的方法补充了他们建立活跃区的实验。β4-Zn、Munc13-1、CaV2.1 和 a2d1 的共转染在HEK293T细胞膜上形成了一种蛋白质复合物，这种复合物与神经元中突触前膜的对接复合物非常类似。为了测试这种复合物是否能将囊泡束缚在膜上，作者在神经元中将 RIM1锌指结构域融合到线粒体蛋白 Tom20跨膜区域的外层并将其命名为mitoC-Zn。作者发现mitoC-Zn靶向线粒体，同时 mitoC-Zn将Munc13-1 招募到线粒体表面，并将囊泡束缚在线粒体的表面。

总体而言，作者通过将 RIM 锌指蛋白结构域（一种能够招募Munc13-1 的小蛋白质结构域）靶向到突触前膜钙离子通道，可以在突触内实现囊泡融合，进而完成神经递质的快速精准释放。这项工作揭示了增加囊泡的融合能力和囊泡与突触前膜的对接是可分离的过程，远离活跃区的囊泡可以被激活进行融合。这项研究也表明， β4-Zn跳过了复杂的活跃区蛋白网络来重建活跃区的功能，是一种人工的简化版活跃区，小分子量的β4-Zn（80 kDa）可用于AAV病毒包装，对改善疾病引起的突触传递缺陷有潜在的应用价值。

原文链接：

https://doi.org/10.1016/j.neuron.2022.01.026

参考文献

1. Tan et al., Rebuilding essential active zone functions within a synapse, Neuron (2022), https://doi.org/10.1016/j.neuron.2022.01.026

2. Sudhof, T.C.. The synaptic vesicle cycle. Annu Rev Neurosci. 2004;27:509-47. doi: 10.1146/annurev.neuro.26.041002.131412.

3. Imig, C., Min, S.W., Krinner, S., Arancillo, M., Rosenmund, C., Sudhof, T.C., Rhee, J.S., Brose, N., and Cooper, B.H. (2014). The morphological and molecular nature of synaptic vesicle priming at presynaptic active zones. Neuron 84, 416–431.