Nat Commun：汪萌、廖祥等与国内多个课题组协作，建立全脑功能联接图绘制新技术

大脑是由数以亿计神经元组成的复杂网络。解析每一个神经元的结构及功能，是神经科学家的梦想，这不仅有助于理解大脑的工作原理，也对于促进人工智能技术发展和疾病诊疗有重要意义。迄今为止，神经科学领域对单个神经元的全脑形态结构解析有了大量进展，已建立涵盖运动皮层、前额叶皮层、海马、纹状体、屏状核和丘脑等多个脑区在内的数千个神经元的全脑形态投射数据库，极大促进了对大脑工作模式的认识；然而并不清楚这些神经元对应的功能是什么。当前迫切需要建立绘制单个神经元功能-投射结构图谱的技术。

2022年3月22日，重庆大学医学院神经智能研究中心汪萌/廖祥团队与陆军军医大学、重庆脑与智能科学中心（广阳湾实验室）、中科院苏州医工所、华中科技大学、广西大学等不同学科课题组合作，在国际综合期刊《自然-通讯》（Nature Communications）发表论文“Brain-wide projection reconstruction of single functionally defined neurons”（全文地址：https://www.nature.com/articles/s41467-022-29229-0，建立了一种称之为2-SPARSE的新技术，综合了双光子钙成像、单细胞电转、病毒标记和fMOST全脑成像等方法，可实现对特定功能的单个神经元全脑范围内的形态投射进行重建。

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2-SPARSE技术分为四个步骤（图1，视频1）。以听觉皮层为例：首先，在双光子成像引导下使用钙离子染料（Cal-520 AM）对听觉皮层神经元进行标记，记录每个神经元频率响应的范围（Frequency response area, FRA）和最佳频率（Best frequency, BF）（步骤1）；为了对功能确定的神经元完整形态进行标记，在双光子成像引导下使用单细胞电转技术将表达Cre重组酶的质粒（pAAV-hSyn-eGFP-P2A-Cre）转入靶定的神经元中，为了进一步增强该神经元投射远端的亮度，在电转神经元旁边注射一个Cre依赖元件介导膜定位绿色荧光蛋白表达的重组腺相关病毒（AAV-hSyn-DIO-mGFP）（步骤2）；表达30天后对标记样本进行灌流取样树脂包埋，使用荧光显微光学切片断层成像系统（Fluorescence micro-optical sectioning tomography, fMOST）对样本进行全脑双色成像（步骤3），最后通过追踪软件对功能确定的单个神经元全脑完整投射形态进行重建并进行定量分析（步骤4）。

图1. 2-SPARSE技术的实现流程（图来源 ：Wang et al., Nature Communications,2022）

视频1. 2-SPARSE技术的实现流程演示

为了展示2-SPARSE技术的效果，研究人员首先选取了同一只小鼠听觉皮层两个对纯音刺激（Pure-tone stimulation）反应相似的神经元（图2a-c，1号和2号神经元），fMOST全脑成像和完整形态重建（视频2）表明这两个神经元展现出不同的投射形态，如1号神经元不仅投射到同侧的颞联合区（Temporal association areas, TEa）和纹状体的尾状核（Caudatoputamen, CP），而且轴突主干穿过胼胝体（corpus callosum, cc）最后终止于对侧的听觉皮层；而2号神经元的投射主要分布在同侧的尾状核（图2d）。

图2. 听觉皮层两个功能相似投射类型不同的神经元展示（图来源 ：Wang et al., Nature Communications, 2022） 

视频2. 听觉皮层长距离对侧投射的神经元标记和重建演示 

另外，研究人员还展示了运动皮层神经元的投射模式。第5层运动皮层神经元投射到众多脑区（图3a-b），其中代表性的34号神经元投射的轴突总长度达212 毫米（图3c）。这一发现表明，2-SPARSE可以可靠地标记单个神经元，并使复杂的运动皮层神经元重建成为可能。

图3. 运动皮层不同投射模式的神经元展示（图来源 ：Wang et al., Nature Communications, 2022）

总之，本工作发展了一种实现精确解析特定神经元功能和结构一一对应图谱的方法，避免了以往病毒标记等策略中高通量神经元重建面临的随机性和不确定性。该技术尤其适用于解析缺少分子marker或者数目稀少但在特定脑区又广泛分布的功能性神经元，如听觉皮层中负责声音编码的“整全性簇状发放细胞”（Holistic bursting cells, HB cells）、皮层和海马中负责处理记忆信息的印记细胞（Engram cells）等。2-SPARSE技术有望推进当前脑科学由单神经元投射组学（Single-neuron projectome）向单神经元功能投射组学（Single-neuron functional projectome）发展。

2-SPARSE技术得利于双光子钙成像、微电极操控和fMOST成像三者的有机融合。其中fMOST成像技术是由华中科技大学骆清铭团队开创，是一种可对大体积生物组织实现细胞水平三维成像的先进光学显微系统，能够全自动的实现大脑神经元网络的连续亚微米分辨率的三维成像及重建，可用于解析神经网络结构从而绘制全脑介观联接图谱。骆清铭团队的fMOST相关研究工作已在Nature、Science、Nature Neuroscience、Nature Methods等国际顶级期刊上发表了多篇论文。2-SPARSE技术的建立得到了fMOST团队的大力支持。

本研究由来自国内的多学科交叉团队联合攻关完成，汪萌为该论文共同第一作者，廖祥、曾绍群、贾宏博和谌小维为共同通讯作者。该研究由国家自然科学基金委、科技部、重庆市科技局等资助完成。

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