Neuron：浙大郭方团队解析节律神经元正反馈回路调控睡眠的机制
2022年5月6日，浙江大学脑科学与脑医学学院郭方研究员团队在神经科学领域国际知名期刊《Neuron》发表题为“Recurrent Circadian Circuitry Regulates Central Brain Activity to Maintain Sleep”研究论文（research article）。
在动物中，睡眠受到生物钟的调节，经典研究强调不同脑区之间的相互抑制控制着睡眠和觉醒之间的状态转换 (Saper et al., Nature, 2005)。然而，昼夜节律神经元和促睡眠脑区之间是否形成维持睡眠的正循环回路尚且未知，本研究揭示的果蝇脑中正循环回路由三个层级的神经元组成：DN1s、APDN3s和CLs。APDN3s是昼夜节律元DN1s和非节律神经元CLs之间的纽带，后者同时又和MB γ叶紧密连接，共同参与睡眠调控。
实验室前期研究表明（Guo et al., Nature, 2016, Guo et al., Neuron, 2018），果蝇的背侧节律神经元APDN1参与了睡眠发起和维持，然而其与下游节律神经回路的连接模式尚不清楚。在本研究中，作者以目前未被研究的DN3节律神经元出发，完整地鉴定了DN1-APDN3-CL-DN1正反馈回路，该回路还投射到大脑的高级脑区蘑菇体（MB），从而维持果蝇的深睡状态。
研究团队利用新的split-GAL4 技术，鉴定出三种不同亚型的DN3节律神经元。其中一簇是只标记2-3个神经元的APDN3s。利用光遗传学激活APDN3s能显著的诱导果蝇睡眠。通过trans-Tango和功能性成像，研究团队发现APDN3s作为一个纽带连接着上游节律神经元DN1和下游非节律神经元CLs。CLs通过接收节律神经元的输出，导致自身 Ca2+呈现出昼夜振荡的模式，在夜间达到高峰。这一模式与DN1和DN3的Ca2+振荡很相似。
促进睡眠的APDN3节律神经元作用于CL神经元
研究发现，在APDN3激活之后的很长一段时间内，CL的钙信号维持在较高水平。作者因此推测CLs可能是自我维持回路的一部分。在小鼠和果蝇大脑中，存在循环发放的回路以维持睡眠( Donlea et al., Neuron, 2018; Zhang et al., Current Biology, 2019a; Zhang et al., Cell, 2019b)。作者假设，在果蝇大脑中CLs和DNs也可能形成一个兴奋性反馈回路。为了验证这一猜想，作者进一步利用跨突触追踪技术证明，CLs能反馈到上游的DN1s，从而DN1-APDN3-CL形成一个维持睡眠的正循环回路,逐渐积累并维持促进睡眠的信号。
光遗传学偶联钙成像技术鉴定CL和下游神经元的功能性连接
接下来，研究团队利用跨突触PA-GFP和活体钙成像技术，证明CLs释放乙酰胆碱来激活MBγ叶，从而驱动睡眠。通过羟基脲诱导的MB凋亡，能阻断CLs诱导的促睡眠作用。表明MB作为下游，对于CL诱导的睡眠是必需的。作者进一步在活体果蝇中利用实时钙成像和运动偶联的范式，验证CLs的激活能导致MB的钙活性升高，同时伴随果蝇长时间的静止状态，证明DN1-APDN3-CL回路的循环发放能激活MB脑区，从而使果蝇入睡。
活体钙成像技术鉴定正反馈回路作用于MB以促进睡眠
综上所述，研究团队首次鉴定了果蝇大脑内一个包含节律神经元的正反馈回路，它们调节高级脑区MB的活性，对于维持睡眠深度起着重要的作用。审稿人认为，论文报道的正循环神经回路是一个突破性的发现，它使人们对睡眠和昼夜节律调节的神经机制有了较为全面的了解，还为深度睡眠和高级认知功能之间的关系提供了一个引人入胜的新视角，这是因为MB同时还是果蝇大脑中的学习和记忆储存的高级脑区。
浙江大学脑科学与脑医学学院郭方研究员为本文的通讯作者，博士生孙利利为本文第一作者。此外硕士生姜睿涵和博士生叶文静也在其中做出了重要贡献。论文在前期研究中还得到了美国布兰迪斯大学Michael Rosbash教授（2017年诺贝尔生理学和医学奖得主）的相关支持。该研究主要受到国家重点研发项目、国家自然科学基金面上项目和浙江省杰出青年项目等资助。本研究感谢浙江大学脑科学与脑医学学院以及浙大附属邵逸夫医院神经内科的大力支持。
郭方课题组成员
郭方实验室长期从事昼夜节律的环路机制的解析，以及生物钟对睡眠，代谢等生理过程的调控机制的研究。在相关领域做出了多项开创性工作，在Neuron（2018，2022）等杂志发表多篇通讯作者文章。课题组欢迎感兴趣的博士后和研究生加入，有意者可联系gfang@zju.edu.cn。
原文链接：https://www.cell.com/neuron/pdfExtended/S0896-6273(22)00349-X
Donlea, J.M., Pimentel, D., Talbot, C.B., Kempf, A., Omoto, J.J., Hartenstein, V., and Miesenbock, G. (2018). Recurrent Circuitry for Balancing Sleep Need and Sleep. Neuron 97, 378-389 e374. 10.1016/j.neuron.2017.12.016.
Guo, F., Holla, M., Diaz, M.M., and Rosbash, M. (2018). A Circadian Output Circuit Controls Sleep-Wake Arousal in Drosophila. Neuron 100, 624-635 e624. 10.1016/j.neuron.2018.09.002.
Lamaze, A., Kratschmer, P., Chen, K.F., Lowe, S., and Jepson, J.E.C. (2018). A Wake-Promoting Circadian Output Circuit in Drosophila. Current Biology 28, 3098-+. 10.1016/j.cub.2018.07.024.
Saper, C.B., Scammell, T.E., and Lu, J. (2005). Hypothalamic regulation of sleep and circadian rhythms. Nature 437, 1257-1263. 10.1038/nature04284.
Zhang, S.X., Rogulja, D., and Crickmore, M.A. (2019a). Recurrent Circuitry Sustains Drosophila Courtship Drive While Priming Itself for Satiety. Current Biology 29, 3216-+. 10.1016/j.cub.2019.08.015.
Zhang, Z., Zhong, P., Hu, F., Barger, Z., Ren, Y.L., Ding, X.L., Li, S.Z., Weber, R., Chung, S.J., Palmiter, R.D., and Dan, Y. (2019b). An Excitatory Circuit in the Perioculomotor Midbrain for Non-REM Sleep Control. Cell 177, 1293-+. 10.1016/j.cell.2019.03.041.
来源：郭方课题组
浙大大学脑科学与脑医学学院