Nature 子刊：瞿佳男/叶玉如团队报道活体高分辨大脑成像新技术
大脑是高等生命体最复杂的器官。在其自然状态下实现对神经元、神经胶质细胞和微血管系统的非侵入式活体高分辨成像对于促进理解大脑生理机能和疾病至关重要【1】。为了实现这一目标，研究人员一直致力于研发能穿过颅骨的大脑活体成像技术。虽然超声成像、正电子发射断层扫描、磁共振成像等技术都能对大脑进行无损成像，但却无法提供足够的空间分辨率来解析亚细胞水平的生物结构和功能。光学显微镜的独到之处在于能够以高空间分辨率提供活体样本的结构和功能信息。然而，当光波在不均匀生物组织（例如哺乳动物颅骨和大脑组织）中传输时就会遇到组织产生的光学像差和散射，从而限制了光学成像的分辨率和深度。近年发展的三光子显微镜 (3PM) 技术是一种使用长激发波长和高阶非线性激发的光学成像方法。与其他光学成像技术相比，3PM有效地减少了散射和背景荧光，在对哺乳动物大脑成像方面已经显示出巨大的潜力【2】。然而，不透明的颅骨和脑组织仍然会严重衰减激发和发射光子并产生光学像差和散射，从而降低成像质量和深度【3】。自适应光学 (AO) 是一种校正光波波前畸变的方法，最早用于大型天文望远镜排除大气产生的像差实现高分辨成像。近10多年AO 已被应用于光学显微镜领域，通过校正组织像差来提高成像分辨率【4】。然而，传统AO技术的波前测量精度和像差矫正准确性都随着成像深度的增加迅速下降。因此，如何在弱信号和大散射情况下准确测量并矫正像差对于在组织深层实现高分辨成像是一个巨大的挑战。
香港科技大学瞿佳男/叶玉如研究组在近年发展了多项AO显微成像技术这基础上（Sciences Advances 2020，Light: Science and Applications 2020, Photonics Research 2021），于2022年6月12日在 Nature Biotechnology 杂志上在线发表了题为 Deep tissue multi-photon imaging using adaptive optics with direct focus sensing and shaping的研究论文，报道了一种新型活体自适应光学三光子显微成像 (AO-3PM) 系统。该系统结合全新自适应光学技术和三光子显微成像，实现了穿过活体小鼠完整头骨在大脑深层的高分辨率大视场成像。AO-3PM大幅提升了非侵入式活体成像的图像质量，为无损研究大脑结构和功能提供了又一强有力的工具。
在这项工作中研究工作者发明了一种称为analog lock-in phase-detection for focus sensing and shaping (ALPHA-FSS 或 -FSS) 的AO技术，对激发光的相位进行特定调制，再利用相敏探测方法对生物组织引入的低阶和高阶像差进行快速精确测量及矫正（图1）。实验证明-FSS技术能够在大背景噪声情况下显著提高测量的信噪比，直接得到激发光在显微镜焦面的电场幅值和相位，并用于准确校正小鼠头骨及大脑组织产生的像差和部分散射。不仅如此，AO-3PM系统还包括另一套共轭自适应光学技术，用于克服矫正波前和生物组织像差随着扫描角度变大迅速解耦的问题，显著扩大了-FSS的矫正有效范围和高分辨成像的视场。
图1：-FSS-3PM系统及对100um厚小鼠头骨引起的像差矫正。(A) AO-3PM系统结构图。(B) 100um厚的头骨下300um深处荧光珠在X-Y平面和X-Z平面的图像，未矫正组织像差（左），-FSS矫正组织像差（右）。(C) 空间光调制器上的矫正图案。(D) B图中沿虚线荧光信号轮廓。比例尺：(B) 2um。
研究人员使用1300nm波长的飞秒脉冲激光作为激发光验证了AO-3PM的成像性能，展示了穿过小鼠完整头骨的体内和体外成像。与传统的三光子显微成像相比， AO-3PM 能够获得更高的空间分辨率，并提升在小鼠大脑深层荧光信号强度最高达数百倍。凭借对低阶和高阶像差的矫正能力，AO-3PM可以在保留完整头骨的情况下能够清晰分辨深皮质区的神经元胞体和树突以及微血管的精细结构，实现了穿过小鼠完整头骨在软脑膜下方750 µm深处的无损高分辨率成像（图 2）。研究者还发现AO-3PM在大幅提升神经元胞体钙离子信号的同时，更能清晰提取出单独树突钙离子信号，从而可以同步记录神经元胞体树突间的电信号关联。在去除头骨后AO-3PM还可获得在软脑膜下方达 1.1 mm深度的海马体高分辨率结构图像。
图2：AO-3PM实现活体穿过头骨对大脑皮质的大范围高分辨成像。(A) Thy1-YFP转基因小鼠大脑内150X150X780um^3范围内对黄色荧光蛋白（YFP）标记的神经元（橙色）和Texas Red Dextran标记的微血管（红色）的高分辨成像。(B) 椎体神经元的最大强度投影（脑膜下方545-555um），未矫正组织像差（上），-FSS矫正组织像差（下）。比例尺：(B) 大图20um，小图5um
最后，研究人员利用 AO-3PM 在保留完整头骨情况下实现了精密激光损伤，并以此研究了微小损伤后大脑皮质内小胶质细胞的响应过程（图3）。结果显示AO-3PM成像可清晰分辨小胶质细胞突起向微米级激光损伤点伸张和包裹的完整过程，有助于研究活体状况下免疫细胞对大脑环境变化的动态反应。同时，研究还表明AO-3PM产生的精密微小激光损伤只引起局部免疫细胞的迅速反应，而100微米外相邻大脑皮质的小胶质细胞并不会发生形态和位置的变化。为了验证在更大像差和散射情况下AO-3PM的性能，研究人员进一步对老年阿兹海默症老鼠大脑的小胶质细胞和淀粉样斑块进行活体成像。结果显示穿过其140um厚的完整头骨，AO-3PM仍然能清晰分辨胶质细胞的精细形态和与淀粉样斑块的相互作用。
图3：AO-3PM实现活体穿过头骨精确激光手术以及老年阿兹海默症老鼠大脑内对小胶质细胞高分辨成像。(A) 激光手术后对Cx3Cr1-GFP转基因老鼠内被绿色荧光蛋白标记的小胶质细胞间隔时间成像。(B) 空间光调制器上的矫正图案。(C) A图中沿虚线荧光信号轮廓。(D) 在12个月大的老年阿兹海默症老鼠大脑对小胶质细胞和淀粉样斑块的双色成像。比例尺：(A) 20um；(D) 10um。
总体而言，这项研究结果表明，AO-3PM 技术在促进活体生物高分辨成像特别是在活体大脑无创成像研究方面具有巨大潜力。
原文链接：
https://doi.org/10.1038/s41587-022-01343-w
参考文献
1. Hua-Tai X, Pan F, Yang G, Gan W. Choice of cranial window type for in vivo imaging affects dendritic spine turnover in the cortex. Nat Neurosci. 2007;10(5):549.
2. Horton, N. G., et al. In vivo three-photon microscopy of subcortical structures of an intact mouse brain. Nature Photonics 7: 205-209 (2013).
3. Wang, T. et al. Three-photon imaging of mouse brain structure and function through the intact skull. Nat. Methods 15, 789–792 (2018).
3. Hampson, K. M. et al. Adaptive optics for high-resolution imaging. Nat Rev Methods Primers 1, 68 (2021).
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