Nature 子刊：两种不同类型的tau蛋白的混合及形成结缠的内在机制

阿尔茨海默病（AD）是由微管相关蛋白tau形成的细胞内神经纤维缠结和由β-淀粉样肽形成的细胞外斑块定义的。Tau蛋白错误折叠形成的神经纤维结缠会损伤神经元正常功能，甚至导致其死亡，至于tau蛋白是怎样混合并结缠的仍待进一步探究。近日，发表在《Nature Communication》上题为“Fluent molecular mixing of Tau isoforms in Alzheimer’s disease neurofibrillary tangles”的文章，展示了两种不同类型的tau蛋白的混合及形成结缠的内在机制，为阿尔茨海默病等神经退行性疾病的发病机制提供了潜在的线索。

研究结果

按照是否存在第二个微管结合重复序列R2，人脑中的微管相关蛋白tau分为四重复（4R）tau和三重复（3R）tau两类亚型。为了确定4R和3R tau 亚型是如何在AD 大脑的神经纤维缠结中混合的，研究人员用固体核磁共振（NMR）的方法，通过将差异同位素标记的4R和3R tau单体，测量这两种异构体的分子间接触情况。结果与设想不同，4R和3R tau蛋白并非以交替形式结合，而是随机混合而成。AD-tau模板化4R-tau、3R-tau以及混合4R和3R-tau原纤维在刚性β-片核或移动域中没有结构差异，无论末端是4R还是3R蛋白，都可以连接周围的任何tau蛋白并补充至正在形成的纤维上。这种随机结合的特性可能解释了为什么阿尔茨海默病在神经退行性疾病中如此普遍。

研究人员将15N或13C标记的重组tau单体与10%的AD脑衍生的沙可辛不溶性tau(AD tau)混合，并用固态NMR对产生的原纤维进行表征。通过向从大脑中依次提取的AD-tau提取物中添加九倍多的0N4R和0N3R tau单体的1:1混合物或两种单体中的一种。透射电子显微镜(TEM)图像显示，添加单体的样品形成的长丝比原始AD-tau种子长。结果为无论将4R tau单独、3R tau单独或两种异构体的混合物添加到AD tau种子中，都可观察到重组tau表现出AD tau的超微结构形态和病理活性(图1)。

图1：同位素标记的重组tau与AD-tau丝接种，发现在WT神经元中保存AD致病活性

研究人员进行15N–13C旋转回波双共振(REDOR)NMR实验，将50%15N标记的4R tau和50%13C标记的3R tau混合在两个独立制备的AD tau种子样品([AD]4RN3RC)中。对AD-tau种子样本具有反向混合标记基序，包含50%的15N标记的3R-tau和50%的13C标记的4R-tau([AD]3RN4RC)。首先测量肝素纤维化0N4R tau样品的氧化还原脱相，该样品含有不同摩尔比的15N标记和13C标记单体。研究人员通过直接对15N标记蛋白质和13C标记蛋白质的不同统计混合物的氧化还原脱相进行实验校准，发现其13C:15N摩尔比范围为0:100%至70%：30%。退相曲线显示预期的趋势：13C标记的tau分数越高，偶极退相越快，S\/S0值越低(图2)。

图2：AD-tau种子化tau纤维的超微结构形态不同于肝素化tau纤维

此外，研究人员再次依靠校准样品更准确的实验重做结果来提取AD-tau纤维的混合概率。通过[AD]4RN3RC样品的光谱产生REDOR退相曲线，反向混合标记的[AD]3RN4RC样品显示出更快的氧化还原退相。最终发现每个4R tau单体的侧面有63%的4R tau，而每个3R tau单体的侧面有56%的4R tau，因此在提供等量的4R-tau和3R-tau单体时，AD-tau丝不能完全分离这两个亚型。此外，用混合商Q=p3→4p4→3/p3→3p4→4表达对同型接触的偏好时，发现Q值越大，越倾向于异型混合；否则，越倾向于嵌段共聚。研究人员再将AD-PHF tau4的低温结构复制到每个原丝中含有360个单体的长丝中，并模拟4R和3R tau交替以匹配测量的p4→3和p3→4个值，发现纤维中4R tau比3R tau丰度更大，以及两种tau异构体紧密而流畅的分子混合(图3)。

图3：15N–13C REDOR NMR揭示AD脑tau丝中tau异构体的混合模式

研究人员测量2D 15N–1H相关NMR谱。偶极hNH光谱选择性地检测到刚性β-折叠残留物，而J-hNH INEPT光谱选择性地检测各向同性的移动残留物。结果发现AD-tau折叠可招募3R-tau单体、4R-tau单体或两者的混合物，而不改变刚性β-片核的构象。此外，在2D INEPT光谱显示四个AD tau种子样品的类似化学位移时，发现对于AD-tau聚集体和体外纤维化tau中的所有异构体，模糊外套的可移动部分具有相似的动态构象(图4)。

图4：AD tau种子丝的2D 15N-1H相关光谱显示与肝素纤维化tau不同的异构体独立的分子构象和动力学

该研究提供了AD大脑tau纤维中4R和3R tau分子混合性质的直接证据。通过1H检测15N-13C-REDOR实验发现tau异构体沿AD-tau纤维轴的分子堆积及垂直于C形β片结构；4R和3R tau在AD-tau种子原纤维中混合良好，4R与3R tau掺入比为60：40，具有较小同型偏好。另外，从二维偶极hNH光谱的相似性可以看出，AD tau原纤维包含4R tau、3R tau或两种混合物而不改变β-片层核心结构，这可能是优化朊病毒生长和繁殖的适应性特征。

与体外组装的tau纤维相比，AD-tau朊病毒将任何一种tau亚型整合到其病理折叠中，两者之间没有交叉接种屏障。这种流畅的分子混合解释了AD tau 原纤维用4R tau扩增的生化观察结果，研究者假设这种流畅的混合可能会促进体内原纤维的生长，使AD称为最普遍的神经退行性疾病。

参考文献

Dregni AJ, Duan P, Xu H, Changolkar L, El Mammeri N, Lee VM, Hong M. Fluent molecular mixing of Tau isoforms in Alzheimer's disease neurofibrillary tangles. Nat Commun. 2022 May 27;13(1):2967. doi: 10.1038/s41467-022-30585-0. PMID: 35624093; PMCID: PMC9142584.

编译作者：臻至秦（brainnews创作团队）

校审：Charlie Brown（brainnews编辑部）

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