生物3D打印通过对生物材料、活细胞以及生化因子逐层精确定位，为体外功能化组织/器官的工程化制造提供了一种有力的手段。与非生物的3D打印相比，由于打印墨水中活细胞的引入，生物3D打印更加复杂也存在着更多的技术挑战，如：满足可打印性和功能化要求的生物材料的选择、满足生物相容、打印精度和制造效率的使能技术的开发等。
近日，清华大学机械工程系生物制造中心在卓越计划高起点新刊Chinese Journal of Mechanical Engineering: Additive Manufacturing Frontiers（AMF）上发表了名为“Advances in 3D bioprinting”的综述文章，对生物3D打印的发展历程和最新进展进行了总结。文章回顾了近20年生物3D打印的发展历程，介绍了生物墨水和使能技术的创新形式，随后总结了生物3D打印在生物医学应用方面的最新进展，并提出了对这一新兴领域的观点与展望。
本文第一作者为清华大学机械系生物制造中心的博士后方永聪，共同一作为清华大学机械系生物制造中心的博士生郭禹志，通讯作者为清华大学机械系生物制造中心熊卓副教授和欧阳礼亮助理教授，作者孙伟教授是清华大学机械系生物制造中心主任。
1.背景介绍
增材制造，也称为3D打印，这种自下而上的制造技术缓解了传统加工方法在制造复杂几何形状和异质成分的产品方面的限制。此外，它也缩短了加工工序，降低了小批量和个性化生产的成本。迄今为止，3D打印已经被应用于众多领域，其中在生物医学领域的应用引起了众多关注。将3D打印与计算机断层扫描（CT）、磁共振成像（MRI）等技术相结合，能够实现个性化的组织建模，用于手术指导和修复。这些无生命的3D打印的发展，促使研究人员开发生物3D打印技术。
早期的生物3D打印工作主要集中在无细胞支架的打印，细胞随后接种在支架上或直接将支架用于体内植入。然而，这种方法存在着局限性，包括细胞接种效率低和难以实现细胞的异质分布。在此基础上，直接打印活细胞的研究逐渐兴起，细胞可以封装到生物墨水中。但对墨水材料和制造方式的生物相容性要求限制了许多传统3D打印技术的直接使用。
在过去的二十年里，许多生物3D打印技术已经被开发出来，被应用于众多生物医学领域，包括组织工程、疾病模型和药物筛选等等。尽管如此，大多数生物3D打印的组织与临床和转化应用还有相当长的距离，临床相关功能化组织的生物3D打印面临着巨大的障碍，特别是：实现组织的异质性以及基本的功能单元（血管、神经和淋巴管）的开发。
本文回顾了生物3D打印的发展历程，重点强调活细胞在制造过程中的引入。随后本文对生物墨水与生物打印技术的最新进展进行介绍。此外，本文重点介绍了生物3D打印下一阶段的前沿方向，包括大尺度组织器官的构建、疾病模型的建立、微生理系统及器官芯片的制造、生物机器人及太空生物3D打印。最后，我们针对功能性组织和器官的工程化及其临床应用提出重要观点。
2.将活细胞作为生物3D打印的构造单元：
生物3D打印近20年发展历程
2.1 从无生命到有生命的跨越
根据打印材料和打印产品的特性，3D打印技术在生物医学领域的应用发展可以分为五个阶段：从打印不需要生物相容性的手术模型和体外医疗设备，到需要一定生物相容性但不需可降解性的永久性植入物，再到应具有生物相容性、可降解性和可吸收性典型组织工程支架，最后再到活细胞作为构造单元被直接打印构建仿生体外组织模型，实现了从无生命到有生命的跨越。最近，3D打印技术在生物医学领域的应用已经推进到第五阶段：类器官或微器官被工程化和组装，以制造复杂的体外生命系统或微生理系统。
最早的生物3D打印工作可追溯到21世纪初期。2003年，Boland等人对商用喷墨打印机进行改装，使其能够打印生物材料和细胞，此后，各种生物打印技术相继出现，包括挤出式生物打印、光固化生物打印等。清华大学与Drexel大学为挤出式生物打印的发展做了突出性的工作。从21世纪10年代开始，生物3D打印在学术界和业界蓬勃发展，第一款商用生物3D打印机、第一本生物3D打印同行评议期刊相继问世。2010年，国际生物制造学会（ISBF）成立。在过去的十年中，生物墨水构造单元与使能技术的创新使得人体组织打印的快速发展。
图1 3D打印技术在生物医学领域的应用发展，根据构造单元的特性分为五个阶段。
2.2 构造单元的创新形式
经典的生物墨水形式是水凝胶前驱体溶液为基质相的单细胞悬液，近年来，创新形式的生物墨水层出不穷。在材料方面，脱细胞基质（dECM）由于其与体内细胞外基质的高度相似性，目前已被直接用于生物墨水的配制。具有特殊物化性质的生物墨水也成为了研究热点，如导电性、自修复性和可变形性。此外，生物墨水构造单元的形式也在不断创新，在传统单细胞悬液的基础上，打印单细胞、微凝胶生物墨水、水凝胶微丝/微纤维生物墨水、细胞球/类器官打印等形式不断涌现，在细胞生物学机理研究、改善生物墨水打印性能、梯度/各向异性组织结构的构建、大尺度异质结构的制造等方面具有重大的意义。
图2 挤出式生物3D打印的早期代表性工作：（a）2002年清华大学开发的第一代细胞打印机及打印过程；（b）使用细胞打印机打印具有高细胞存活率和生物功能的肝脏结构体。
图3 生物墨水的创新形式：（a）使用小型细胞分拣机进行高分辨率单细胞生物打印；（b）压实的微凝胶作为生物墨水，在悬浮胶中进行生物3D打印；（c）相互缠绕的水凝胶微丝作为生物墨水和打印的肌肉组织；（d）自愈合水凝胶中细胞球的生物3D打印。
2.3 生物打印使能技术的创新
目前生物3D打印的技术根据几何维度可被划分为三类：零维（点）、一维（线）和二维（面）。零维的使能技术包括激光诱导转移、喷墨生物打印、阀式打印等；挤出式生物打印与光固化生物打印是一维与二维的代表性技术。此外还有一些新型的生物打印技术，如声波和磁场生物打印。总的来说，挤出式生物打印与光固化生物打印是目前使用最广、商业化最好的打印技术。挤出式生物打印对具有相对较广的材料适用性，但其存在着精度较低、细胞损伤等问题。在挤出式的基础上，微流控打印和悬浮打印等策略相继推出，实现了复杂和异质性结构的制造。光固化生物打印可分为立体光刻（SLA）和数字光处理（DLP）。DLP生物打印技术由于其快速的打印速度、高分辨率和相邻层之间的强粘性而取得了很大进展。近年来体内三维生物打印策略也被提出，其能实现体内无创宏观组织的打印。此外，一种新的光固化生物打印形式——体积生物打印，已经被开发出来，大大提高了打印效率和准确性。
图4 生物3D打印使能技术的代表性进展。(a) FRESH技术：重建人类心脏部件的胶原生物3D打印技术；(b) SLATE技术：通过数字光处理（DLP）技术打印的3D复杂结构，模仿人体肺泡结构；(c) 体内生物打印：使用近红外（NIR）光对人耳形构造进行打印；(d) 体积生物打印：通过在旋转的容器中用多种光照模式固化水凝胶前驱体溶液来制造复杂的组织模型。
3.迈入下一阶段：生命系统的打印
在本节中将介绍生物3D打印在生物医学应用方面的最新进展，包括大尺度组织和器官的打印、疾病模型的建立、微生理系统和器官芯片的构建、生物机器人和太空生物打印。
表1 生物3D打印在不同生物医学应用中的优势和挑战。
3.1 大尺度功能化组织器官的打印
生物3D打印在制造高度复杂性的含血管结构的大尺度组织器官过程中，仍然存在巨大障碍。一方面生物墨水的材料往往太软，成型性较差，难以打印复杂组织。研究人员引入聚合物支架作为打印结构的永久或临时支撑。除此之外，使用悬浮生物打印策略也是一种解决办法。另一方面是缺乏多级血管结构。在过去的几十年里，不少解决方案相继提出。其中，牺牲模板策略在三维血管化组织工程中越来越受欢迎，Pluronic F127、明胶和一些碳水化合物已被用于制造牺牲模板。另一个能够生成血管通道的策略是使用悬浮打印技术进行全向打印，这种策略对大规模的血管组织具有更高的打印速度。
图5 大尺度功能组织器官打印。(a) 在悬浮浴中3D打印微型人类心脏模型；(b) 同时打印含细胞的生物墨水和牺牲生物墨水制造的3D血管化组织；(c) 在由心脏类器官组成的悬浮介质中打印心脏组织。
3.2 疾病与癌症模型的打印
在体外建立疾病模型尤为重要，能够大大降低药物研发的成本，减少动物模型使用。癌症是最具危害性的疾病之一，肿瘤的发生、发育和迁移涉及一系列复杂的过程，这使得肿瘤的体外建模极具挑战性。生物3D打印对细胞位置精确的控制能力为构建具有高度异质性微环境的体外复杂肿瘤模型提供了可能。目前不少肿瘤模型相关研究中常用的细胞是永生化细胞系，它们已经失去了原始肿瘤的遗传表型和功能。因此，使用源自患者的原发性肿瘤细胞已经得到了普遍认同。利用患者来源的肿瘤细胞，生物3D打印的肿瘤模型可以重建体内的肿瘤微环境，并保持原始肿瘤组织的组织和结构特征。除此之外，生物3D打印的肿瘤集合体模型也被开发出来，它可以准确模拟成熟的器官结构和相关的组织微环境。
图6 疾病和癌症模型的生物3D打印。(a)二维培养和三维生物打印模型在第5天和第8天的细胞骨架染色；(b) 源自人类肺部（P1）、肝脏（P2）和胃部（P25）肿瘤的器官组织学图像，以及与其母体肿瘤的比较；(c) 生物3D打印膀胱肿瘤集合体的示意图。
3.3 微生理系统和器官芯片的打印
器官芯片是体外细胞培养技术与微流控芯片的结合，为创建动态的人体生理组织模型提供了一种新的方法。迄今为止，许多人类器官包括肝脏、肺、肾脏、肠道等器官的芯片已经成功制造出来，并能很好的模拟原器官的功能。尽管如此，仍有一些问题需要解决：(1) 难以实现多器官模拟；(2)目前普遍使用的PDMS材料，细胞很难粘附；(3)在芯片高度方向上很难改变细胞排列。考虑到这些问题，3D打印的微流控芯片的相关研究越来越多。因为3D打印不需要复杂的步骤和特定的模具，降低了成本也提高了效率，并且能够实现多材料集成，提高结构的功能性。此外，3D打印的微生理系统能使多个器官特异性细胞之间发生串联。总之，3D打印技术使器官芯片领域发生了革命性的变化，将大大促进器官芯片系统的转化应用。
图7 器官芯片的3D打印。(a)带有应变传感器的3D打印心脏微生理装置；（b）3D打印的内皮化肝脏微阵列；（c）3D打印的肾脏近端小管芯片；(d) 无孔隙3D打印用于原位微流控灌注；（e) 带有肝脏、心脏和肺部模块的器官芯片系统。
3.4 生物机器人的构建
随着生物制造技术的快速发展和组织工程的进步，生物机器人（biobots）引起了广泛的关注。2005年，第一个由心肌细胞驱动的行走生物机器人被开发出来。此后，研究人员通过采用具有收缩细胞作为执行器的生物组件，设计了各种具有仿生行为和功能的生物机器人。生物3D打印和微加工技术能够制造具有特定形状的软质材料，从而降低水阻。此外，通过定制特定表面形态或化学梯度的基质材料，可以诱导心肌细胞和肌肉细胞的排列，以增强其收缩力。与传统的软体机器人相比，生物机器人有几个优点，包括微型化、内在的柔软性、较高的能量转换效率和环境兼容性。尽管在过去十年中取得了重大进展，但该领域仍处于起步阶段，存在着较短的寿命等挑战。
图8 生物机器人的代表性例子。(a) 通过3D打印技术制造的小型化行走生物机器人的示意图及行走过程；(b) 通过光学刺激控制4层结构的人造黄貂鱼及工程黄貂鱼的细胞排列和纳米结构。
3.5 太空生物打印
随着空间技术的发展，空间已成为许多国家竞相抢占的重要战略高地，空间探索也已成为经济发展的新引擎。生命可以自我复制和自我修复，在未来有机体可以作为原材料，通过生物3D打印技术在太空轨道上生产食物、燃料、定制工具甚至器官。迄今为止，一些商业公司已经在太空中进行了一系列的生物3D打印实验。直接利用动物细胞进行生物3D打印在太空中制作食物，有望解决长距离太空旅行中的食物短缺问题。2019年，Aleph Farms等公司通过在磁悬浮液中进行太空生物打印，成功制造出第一块人造肉。。除了用于医学用途的人体组织构建工程外，太空中的生物3D打印还可用于研究微重力和宇宙辐射对人体组织的影响，这对于扩大我们对太空旅行的理解具有重要意义。
图9 太空生物打印。(a)在国际空间站的轨道上对人类软骨组织进行3D打印；（b）太空中生物3D打印人造肉；(c)通过磁悬浮组装3D打印高质量蛋白质晶体。
观点
时间的重要性：生物3D打印使得工程化器官更好的生长
一个器官本质上是复杂的，其微环境涉及动态和异质的细胞-细胞和细胞-ECM相互作用。在动态的形态发生和器官形成过程中，时间是非常重要的，其也被称为第四维（4D）。人们期望在未来，通过结合生物打印和后续培养，可以在体外“养”出一个器官。因此，目前许多研究集中在将4D培养整合到3D生物打印中。近期，不少使用时间可调的种子细胞和生物墨水材料的策略被提出，例如在主导细胞外添加基质细胞对ECM进行修复与重塑、使用可逆化学键交联的动态水凝胶材料作为基质相、使用可响应外部物理因素（光、声波、热、电和磁场）的生物墨水对细胞进行程序性调控等。
面临的挑战：从实验台到手术台的跨越
让生物3D打印技术从实验室走向临床应用仍然有很长的路要走。目前原位或体内生物打印的概念已经得到广泛认同，在这一领域中，基于柔性机械手、远红外光固化的体内打印等研究成果进展迅速，但仍面临着许多与转化应用相关的挑战。另外，到目前为止，仍然需要高效的细胞扩增技术来生产能够用于临床数量级的细胞。生物3D打印组织的转化应用也面临着监管方面的挑战，由于治疗机制的复杂性和在人体中的长期影响尚不清楚，它们与传统的临床产品存在着本质上的区别。因此，迫切需要制定生物打印过程的标准化和质量要求，以确保3D生物打印组织的安全性、有效性和可重复性。此外，生物3D打印组织的低温保存和运输也应被考虑在内。
总结
综上所述，生物3D打印技术已成为构建工程化复杂组织的一种有力手段。近年来，构造单元和使能技术方面的进展大大扩展了生物3D打印构建复杂功能化组织的能力，并进一步拓展了其在疾病模型、微生理系统和生物机器人方面的应用。然而，在转化应用之前仍有许多挑战需要解决。随着微加工技术、干细胞和智能生物材料的融合，预计生物3D打印技术将快速发展，构建具有所需功能的工程化复杂生命系统。
参考文献
Yongcong Fang, Yuzhi Guo, Tiankun Liu, et al. Advances in 3D Bioprinting. Chinese Journal of Mechanical Engineering: Additive Manufacturing Frontiers, 2022,1(1):100011.https://doi.org/10.1016/j.cjmeam.2022.100011
编辑：李 娜 校对：金 程