追问顶刊 | 《自然》杂志：是什么影响了大脑皮层的发育？耶鲁研究团队独家回应追问编辑部
# 追问按
宇宙之于人类，是亘久运行的谜，而人类自身的“三磅小宇宙”——大脑，也让无数科学家为之倾倒。层出不穷的研究让我们一步步接近真实，也让我们愈发困惑。由此，追问公众号推出全新栏目“追问顶刊”，我们聚焦公众瞩目的发布在Science和Nature等期刊的重磅研究，我们与研究的主导者进行深入对话，我们与您一起聆听他们对于研究的解读。
在本期“追问顶刊”中，我们与读者一起追问了Nenad Sestan团队的助理研究员齐才博士。Nenad Sestan之前因复活死亡猪脑而广受关注，最近他们团队在《自然》杂志连续发表了两篇探究视黄酸调节大脑前额叶皮质结构和连通性的文章。本次采访基于最近的这两篇研究，以下为具体内容，欢迎阅读。
Nenad Sestan 实验室
耶鲁大学医学院
Nenad团队研究集中在了解不同神经元的特性以及在大脑皮层形成相应突触连接的分子和细胞基础。实验室还关注这些复杂的发育过程是如何演变的，研究方法主要为：1）利用遗传上可行的小鼠模型分析演化上保守的发育机制，2）对非人灵长类动物和人类进行比较基因组和细胞分析，以确定人类特有的大脑发育特征，以及3）对人类神经发育障碍进行遗传和分子分析。
齐才：北京大学神经科学研究所获得博士学位，现为耶鲁大学Nenad Sestan实验室助理研究员。博士期间研究神经元树突的形态发生，现主要从进化的角度研究大脑皮层发育和相关疾病的分子机理。
本文由追问编辑团队呈现
问题筹备：Jiahui，立夏
采访：Jiahui，立夏
编辑：立夏，Jiahui，EY
Q
请先简单介绍一下您所在实验室的研究领域。
齐才：我们实验室的研究主要是通过高通量测序的手段，比较转录组和比较基因组的研究人脑的发育与其他物种相比有什么独特之处。
Q
我们今天采访的重点是近期您所在的团队发表在Nature上的两篇论文。可以用通俗易懂的话向我们简单介绍一下这两篇论文的重点？
▷ Nenad Sestan团队发表在Nature上的两篇文章
齐才：我们这两篇文章主要回答了人的前额叶皮质（PFC）在发育过程中受什么样的信号通路控制，受哪些基因调控以及如何调控。
实验室前期的RNA测序（RNA-seq）数据提示视黄酸信号通路在人类前额叶皮质发育的时期是相对富集的，因此我们推测它在人前额叶皮质的发育中有很重要的作用。第一篇文章主要回答视黄酸的信号通路是怎么起作用的。首先我们对PFC的RNA-seq数据做基因聚类（gene ontology）的富集分析，发现视黄酸信号通路高度富集并且在人、恒河猴和小鼠中呈现不同程度的富集，而前额叶皮质在演化的过程中在人类的大脑皮层也呈现不同比例的面积增加，所以我们就猜测视黄酸与人类PFC的增大和它的神经环路的连接复杂性是有关系的。为了在分子遗传学水平上验证这一假说, 我们分析了视黄酸代谢的合成酶和分解酶的表达, 并制作了视黄酸受体的基因敲除小鼠。我们的确发现合成视黄酸的酶和视黄酸报告基因的信号的确在小鼠与人类前额叶皮质同源的脑区表达，并且影响突触形成。第二篇文章则重点回答这条信号通路的一个下游基因CBLN2 如何在不同的物种受到不同的调控呈现出不同的表达并影响突触形成。
Q
为什么会选择视黄酸作为研究对象？
齐才：最初选择视黄酸信号通路作为研究对象是经过对测序数据进行差异分析的结果。具体来说为了将分析得到的数据进行生物过程的验证。我们先验证了视黄酸信号通路的表达，为此我们用了视黄酸受体的报告基因。顾名思义它是受视黄酸信号驱动来表达的。我们的实验结果显示在野生型的报告小鼠中，它主要表达在内侧前额叶皮质（mPFC），相反，在视黄酸受体敲除的小鼠中，这里信号就明显降低了，也就是说视黄酸信号通路集中在这里。此外，因为小鼠的mPFC跟丘脑有连接，我们也检查mPFC跟丘脑的连接与视黄酸信号通路有没有关系。我们把示踪染料放在皮层或者丘脑上，它会被神经元吸收，在显微镜下就可以通过检查被染料标记的区域推测脑区之间的连接。在视黄酸两个受体（一个是γ，一个是α）双敲的脑子中，丘脑和mPFC的连接与野生型的小鼠相比明显降低了，这些结果提示视黄酸信号影响丘脑和mPFC之间环路的建立。此外我们把一些跟视黄酸受体相关的基因做了原位杂交，我们发现这些基因的表达也呈现mPFC富集，包括刚才提到的Cbln2。此外我们发现视黄酸代谢过程中降解视黄酸酶则不在小鼠的mPFC富集，反而比较少。为此我们进行了一系列的深入研究。
▷PFC富集区域视黄酸的浓度梯度
Regulation of prefrontal patterning and connectivity by retinoic acid. （Fig.2）
Q
可以和我们简单介绍下第二篇文章中的研究对象基因CBLN2吗？
齐才：我们的第二篇文章想回答是什么在控制视黄酸信号的下游基因Cbln2。我们想知道它表达在PFC呈现差异表达的的遗传学基础是什么：我们的原位杂交结果显示CBLN2在人类PFC的表达是比较高，并呈现出前后轴减弱的趋势。在小鼠的前后轴水平上也呈现类似的模式，前高后低。然而在垂直方向上，在人的皮层中可以看到它从上到下都有明显的表达。在恒河猴里，它是富集在上层，下层虽有却减弱。而在小鼠里只在非常表层的地方有表达。所以我们就想回答为什么它特异性地在人类或者是在灵长类里表达更广泛。我们通过ChIP-seq的方法分析了一下影响它表达的一些顺式作用元件:它的启动子和增强子，并找到了三个可能的顺式作用元件：增强子1、2，还有启动子。通过比较人类、恒河猴和小鼠我们发现，在演化的时候第二个增强子在人类基因组里有一段碱基缺失，因此我们就猜测小鼠里有的这段序列对Cbln2来说有抑制表达的作用。而有了这段序列之后我们就可以知道这段序列会被什么转录因子结合。为此我们找到了两个转录因子，其中一个正好就是视黄酸受体，它可以促进Cbln2的表达。另一个转录因子叫SOX5，实验分析发现SOX5 抑制Cbln2的表达。因此我们知道因为在人的大脑皮层中因为缺失了一段序列反而解除了对CBLN2表达的抑制作用使得其表达更为广泛。
▷ PFC发育过程中CBLN2基因的系统发育、转录组和调控特征
Hominini-specific regulation of CBLN2 increases prefrontal spinogenesis.（Fig.1）
Q
刚刚我们讨论了视黄酸是怎么调控基因在PFC中的表达的。我们可以认为一些高级的认知功能背后的遗传机制，是始于PFC中视黄酸信号的增加，或者它调控的基因表达的增加吗？
齐才：可以这样说，但最终还是取决于神经连接的多少。所有的疾病都是和神经环路有关系的，是神经环路功能障碍。
Q
这两篇文章研究的是人、猴子还有小鼠。这三者都是哺乳动物，而其他的动物也有类似于PFC的区域。做演化方面的比较时，有考虑把比较的物种类型再扩大一些吗？
齐才：我们这个研究里面没有，因为PFC的定义在不同的研究人员看来是不一样的。比如小鼠里的mPFC，有一部分人认为它同源于人类的PFC，这个本身也是有争议的。但是这个问题很有意思。我们使用合适的研究对象回答我们感兴趣的生物学问题。
Q
做小鼠研究的时候敲除了视黄酸受体基因，然后检测其在整个PFC区域内表达量的变化。有没有做相关的过表达研究？
齐才：这是个好问题。在我们文章发表之后也有一篇Nature的文章，他们受到我们的启发，用维生素A来培养大脑的类器官（organoid），然后通过测序发现用维生素A培养大脑的类器官更能诱导产生PFC的细胞类型。这从另一个方面提示视黄酸信号在前额叶皮质发育过程中的重要性。
Q
对于视黄酸的研究，有下一步的研究方向吗？
齐才：每一篇文章在回答一个问题的同时往往也会引出新的问题，比如视黄酸是怎么影响PFC的独特性：通过作用于神经干细胞还是分化之后的神经元？视黄酸从哪里来，2009年UCSF的Samuel Pleasure 研究组在Cell 杂志报道小鼠脑膜产生的视黄酸影响皮层发育，但在人脑里视黄酸从何而来尚不得而知。我和我的同事们也在围绕这些问题做进一步的研究。
▷ Samuel Pleasure 团队发表在cell上的文章
Q
还有其他基因影响PFC的发育吗？
齐才：我们的测序数据也分析得到了一些其他的影响神经发育的基因在人脑的前额叶皮质突触建立时呈现高表达，我们正在研究这些基因是否也会影响前额叶皮质的发育。此外我们也会围绕视黄酸信号通路做下一步的研究。
Q
这两篇文章讲视黄酸信号通路的下游的调控。您所在的团队有研究控制视黄酸合成这个通路的影响吗？
齐才：我们在做这个工作。我们正在研究改变视黄酸代谢途径中的合成酶和降解酶对前额叶皮质发育的影响。
Q
刚刚我们说到从人脑的前额叶皮质的表层到它的更深的区域，视黄酸的信号通路的一些基因呈现下降的趋势。你觉得这会是人脑的性能或者其他方面区别于其他动物的关键吗？
齐才：我们的研究显示视黄酸是影响人前额叶皮质发育的关键因素之一。至于功能一方面因为无法对人的发育进行干扰进行研究而使得这个问题无法回答，另一方面对基因工程小鼠进行一些行为学测试或许能提供一些线索。人脑的演化可能是造成人的独特性的关键因素。
Q
我们还很关注一些发育障碍相关的精神疾病，比如自闭症。您认为视黄酸信号通路在这些疾病的发生发展过程中会有一些什么样的作用？
齐才：视黄酸信号通路在精神分裂症里面的作用报道比较多，可以查到很多文章说到视黄酸信号通路。比如降解视黄酸的酶的基因Cyp26b1，有报道显示它可能与精神分裂有关联，而前额叶皮质功能紊乱是精神分裂的原因之一。此外神经科学的教科书上有一个病例，患者名叫 Phineas Gage, 一根铁棒从他的脑子斜插过去导致他的前额叶皮质被破坏了，他最后性情大变，暴躁易怒。所以我们认为视黄酸信号相关基因很有可能与精神疾病有关。
Q
针对这两篇文章的后续工作，您实验室接下来的安排方便分享吗？
齐才：如前所述，我们后面会验证分析得到的其他基因是否以及如何影响前额叶皮质的发育，例如神经营养因子家族BDNF 等。另一方面我们将通过分析改变视黄酸代谢过程中的关键酶是否影响前额叶皮质发育开展后续的研究工作。
Q
除了这方面的研究之外，您还对神经科学的其他领域感兴趣吗？
齐才：我博士是做神经细胞发育，博士后做皮层发育，我比较感兴趣的是神经环路建立的分子机理，这些分子机理异常如何导致精神疾病，以及人类大脑的独特性与精神疾病的发生有怎样的关系。
Q
在未来5~10年，您的研究目标是什么？或者您有什么终身的研究目标吗？
齐才：我希望将来技术的进步能够让神经科学研究的分辨率提高使得我们可以逐步接近科学谜题的真相。
Q
作为一个青年科学家，从您的角度出发，您认为青年科学家需要哪些支持或者帮助？
齐才：随着技术的发展，每个领域越来越细化，合作也变得越来越重要，另一方面，大家的交流也变得越来越困难。希望有一些举措能使使不同研究方向之间的人的交流更加顺畅，真正使学科交叉变得越来越容易。第二，现在做一个重要的工作需要的数据量越来越大，需要的时间越来越长，我希望大家能够给青年科学家多一点耐心，多一点包容和支持。
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