如何进行SNP/InDel检测及其影响因素？
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关键词：SNP/InDel、准确性、验证
当不同个体的基因组序列被测序后，相对人基因组参考序列而言，肯定存在差异：
SNP：若只是序列上有一个碱基的不同，如参考基因组上某位置是A，而被测的人该位置是C，则该位点存在Single Nucleotide Polymorphisms（SNP）,即在人群中该位点存在单个核苷酸的多态性。
MNP：Multiple Nucleotide Polymorphisms是相对于SNP而言的，连续多个碱基与人基因组参考序列不一致；
InDel：存在一个或多个碱基对相对参考基因组序列被插入或删除，则称为INsertion and DELetion；长度一般在1kb以内；
SV：相对人基因组基因组序列存在1kb到3Mb长度的插入、缺失、倒位、易位，并会导致出现特殊的现象：如融合基因 Fusion gene，即两个基因置于同一套调控序列下，构成的嵌合基因；如拷贝数变异 Copy number variation/CNV，即某基因组片段的拷贝数增加或减少（当然也会存在其他机制导致融合基因和CNV的出现）。
今天我们主要来看看SNP/InDel的特点及其如何对它们进行检测。
SNP相关的特征或概念：
分子遗传标记物：在人基因上约1000nt就会存在一个SNP，一般频繁出现在CG序列上，并多数为C脱氨为T；
转换transition/颠换transversion：转换是指嘌呤与嘌呤之间或嘧啶与嘧啶之间的变异；颠换是指嘌呤与嘧啶之间的变异；
从氨基酸角度来定义分为三种：Synonymous同义突变（对应的氨基酸序列没有发生变化）、Missense错义突变（在一个密码子中一个碱基的变化导致编码出了另一个氨基酸，即对应的氨基酸序列发生了变化）、Nonsense无义突变（在一个密码子中一个碱基的变化导致出现终止密码子）；
从进化角度来讲：在人基因组上同义突变的比例会相对错义或无义突变较高；虽是同义突变或非基因区的突变，不会改变氨基酸的序列，但是可能会影响转录因子、基因剪切、mRNA的降解等，因此也不可忽视它们的存在哦。
SNP多态性：一般在人群中某个位点只存在两种碱基形式，但也存在三种或四种的情况；
InDel相关的特征或概念：
移码突变：当插入或缺失的碱基个数不是3的倍数时，并使得DNA的读码框发生改变，导致插入或缺失位置之后的所有密码子都跟着发生变化。
非移码突变：当插入或缺失的碱基个数是3的倍数时，并在开放阅读框内，则读码框不会发生改变；相对移码突变，该种Indel比较常见。
从遗传角度来看，SNP/INDEL还可划分为种系突变germline mutation和体细胞突变somatic mutation两种。简单的来说，种系突变是从父母那遗传得到，因此突变频率理论上应该是100%或50%或为野生型；体细胞突变可以理解为在日后生活中，接受某些外在影响的条件下，发生了DNA序列的改变。
从突变频率来讲，SNP/InDel还可划分为野生型（wildtype）、杂合突变（heterozygous）和纯和突变(homozygous)。野生型是指检测某位点的碱基是与人基因组参考序列上的一致，如人基因组参考序列上某位置是T，那野生型为TT；纯和突变是指某位置的碱基与参考序列不一致，均是另外一种碱基型，如CC；杂合突变是指某些DNA序列中该位置的碱基与人基因组参考序列一致，一部分DNA序列中该位置的碱基与人基因组参考序列不一致，如TC。
利用samtools进行变异检测
如果利用的是液相杂交捕获方法并经过了PCR过程，则需要先删除其中的duplication reads：
samtools rmdup aligned.sorted.bam aligned.sorted.rmdup.bam
samtools mpileup -l $Target -q 30 -Q 30 -L 10000 -D -S -m 3 -uf hg19.fa aligned.sorted.rmdup.bam | bcftools view - >raw.vcf
其中-l参数是指定对哪些区域进行变异检测；
其中-q参数是指定用于突变检测的reads比对质量必须大于等于30；
其中-Q参数是指定用于变异检测的reads中的碱基的质量值必须大于等于30；
其中-L参数是指定用于InDel检测的测序深度，默认是250X；
其中-D参数是指定输出每个位点的覆盖深度；
其中-S参数是指定输出每个位点的链偏好性P值；
其中-m参数是指定InDel的最小覆盖深度；
其中-u参数是指定输出非压缩的BCF文件格式；
其中-f参数是经过samtools fadix处理过的人基因组参考序列文件。
存储SNP/InDel变异的VCF文件的格式：
文件示例如下图，包括注释部分和结果部分。
注释部分写明了结果部分中所有标签的含义，结果部分是展示每个变异结果的详细信息。
第一列CHROM是SNP/InDel所在的染色体号；
第二列POS是SNP/InDel所在的染色体上的位置；
第三列ID是SNP/InDel在其他数据库中的编号，如图中展示的dbSNP数据库；
第四列REF是人基因组参考序列上该位置的碱基序列；
第五列ALT是被检测人在该位置上的碱基序列，其中“.”表示被检测人该位置的碱基序列与参考序列一致；
第六列QUAL是用数值来表示SNP/InDel被检测的准确性；
第七列FILTER指该SNP/InDel是否满足所有过滤条件，若满足则填写为PASS，若不满足哪一条过滤条件，则填写相应的标识；
第八列INFO可存储各种信息，格式为<key>=<data>;<key>=<data>;…，例如DP4=62,48,10,12的含义为参考型碱基的正链覆盖深度、参考型碱基的负链覆盖深度、突变型碱基的正链覆盖深度、突变型碱基的负链覆盖深度；
第九列FORMAT是指定之后每列的格式及数值的含义。
其他进行变异检测的软件
SNP/InDel检测的准确性与实验验证
那为何有多个软件或算法进行SNP/InDel的检测呢？其实进行SNP/InDel检测是一个很复杂的过程，有很多影响因素。
下面列举三条，但因为会不断的有新的软件或算法涌出，大家要不时的关注最新科研进展哦：
1） 测序深度：由于探针GC含量等导致某区域depth很低，如何在低覆盖度的情况下进行准确检测呢？
2） 测序错误率（如下图i）、PCR导致的错误(如下图ii)、链偏好性(如下图ii、iii)等，如何通过算法进行准确的识别呢？
3） 在存在InDel区域的比对准确性，如何对比对结果进行校正，进行准确的检测呢？
尽然存在很多影响因素导致变异检测的准确性，那当遇到一个低质量、但突变的临床意义又是很重要的情况下，如何验证其准确性呢？
首先我们可以通过直观的方式查看突变所在区域reads的比对情况，如samtools tview –p chr7:55259515 aligned.sorted.rmdup.bam hg19.fa，图示为缺失突变后跟了一个SNP：
其次可通过一代测序（可验证突变频率大于20%的突变，如下图）或数字PCR（可检测低至0.1%或0.01%的突变）的方法进行验证。
以上内容讲解了SNP/InDel的概念、检测软件、存储SNP/InDel的VCF文件格式、影响其检测准确性的多个因素及实验验证方法。
大家是否对SNP/InDel有了更深入、更全面的了解了呢？
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