解读：双波长差吸光度法及后分光技术的应用和发展前景！！！

建立在Lambert—beer定律基础上的单波长分光光度分析技术，应用极为广泛，但由于单波长法存在混浊试样对光的散射和比色杯背景吸收等难以克服的缺点，它在高精度测量中的应用受到一定的限制。为了解决浑浊试样对分光光度测定的干扰问题，美国的B.Chance于1951年制成了用振动镜使两束不同波长的单色光交替通过待测溶液的双波长分光光度计（Double Wavelength Spectrophotometer）,从而奠定了双波长分光光度法的基础。随着科学技术的发展，双波长分光光度分析技术已日臻完善，与先进的后分光技术相结合，在生化自动化分析中得到了广泛的应用并显示出了光明的发展前景。

1、 双波长分光光度法的原理

双波长分光光度法是在传统分光光度法的基础上发展起来的，它的理论基础是差吸光度和等吸收波长。它与传统分光光度法的不同之处，在于它采用了两个不同的波长即测量波长（又叫主波长λp, Primary Wavelength）和参比波长（又叫次波长λs, Second Wavelength）同时测定一个样品溶液[1,2]，以克服单波长测定的缺点，提高了测定结果的精密度和准确度。

早期的双波长分光光度计在测定时，两束不同波长的单色光经斩光器（Chopper，一种用于双波长分光光度计中使光束按一定周期反射，遮断或通过的装置）处理后，以一定的时间间隔交替照射[1]比色杯，经待测溶液吸收后，再照到光电管上，产生两个不同的吸光度，再将这两个吸光度相减，就得到了差吸光度ΔA。根据Lamber—Beer定律, 
得：
Aλ p=ελpLC+Ap (1)
A λs=ελsLC+As (2)
式中 Aλ p 、 A λs—分别为待测溶液在主波长和次波长处的吸光度，ελp 、 ελs—分别为待测溶液在主波长和次波长处的摩尔吸光系数
L—光径
C—待测溶液的浓度
Ap 、As—分别为待测溶液在主波长和次波长处的散射或背景吸收
当λp 、λs相差不太大时，由同一待测溶液产生的光散射吸光度和背景吸光度大致相等，即Ap＝A s，将（1）式－（2）式得：
Aλ p－A λs＝ΔA＝（ελp－ελs）LC （3）
对于同一待测溶液来说，ελp－ελs是一常数K，在光径L不变的情况下，（3）式可简化为：
ΔA＝KC （4）
（4）式说明，待测溶液在λp与λs两个波长处测定的差吸光度ΔA与试样中待测物质的浓度C成正比。这就是双波长法赖以建立的定量公式［1,3］。
双波长差吸光度法具有可以克服溶液浑浊的影响 、共存组分吸收谱线叠加的干扰，以及减少比色杯的光学不均一等优点。它的差吸光度在2.5以内时，线性范围良好。

2 、选择双波长的方法[1,3]

双波长差吸光度尽管有许多优点，但是如何正确选择双波长，则是应用的关键。选择双波长常用的方法有三种：
2.1 根据待测溶液对吸光谱的吸收曲线，选择最大吸收峰对应的波长为λp，吸收曲线下端较为平坦的某一波长为λs。
2.2 选待测溶液嗫大吸收峰对应的波长为λp，选等吸收点的（Isosbestic Point）对应的波长为λs。 所谓等吸收点，是指对于某个波长，尽管待测溶液的浓度不同，但对该波长的光的吸收均相等。

等吸收点所对应的波长叫做等吸收波长。对于吸收光谱具有吸收峰的物质，同浓度下吸光度相等的两个波长，也是等吸收波长。等吸收波长是双波长法的理论基础之一。应用这一方法的必要条件是能准确地测定出等吸收点，否则将造成显著的误差。
2.3 
选溶液最大吸收峰的波长为λp，选显色剂的最大吸收峰对应的波长为λs。该法又称为双波长增敏法，它的原理是：当向一定浓度的显色剂溶液中加入待测物时，由于生成物质浓度的增大，生成物的吸光度也随之增大，而显色剂则由于不断消耗，其吸光度逐渐减小。如果以λp为测定波长，λs为参比波长时，测得的差吸收光度显然是生成物吸光度与消耗的显色剂的吸光度之和，从而提高了测定的灵敏度。

由上述方法可以看出，双波长法选择主波长的原理与单波长法相同：均选择待测溶液最大吸收峰对应的波长，所不同的是双波长法还应根据不同条件选择次波长。
文献指出［1］，影响双波长法测定精密度的因素是：光辐射噪声，电源不稳和读出噪声，采用强光源可以改善测定的精密度。当试样中含有干扰物质时，由于双波长法减少了样品的形式误差，故测定的精密度优于单波长法。

影响双波长法准确度的因素是：①由化学干扰物引起的误差，但这种误差要比单波长法小得多；②由物理干扰引起的误差，但可以通过采用较小的双波长差等方法来减少误差，而且这种误差本身就比单波长法更小；③由仪器的非理想性如比色杯的性质和位置，以及信号失调、狭缝过大和杂散光等引起的误差，其中尤以后者引起的误差为大，因此要求仪器的波长精度在高并且尽量减少杂散光。

3、后分光技术及其在仪器上的应用

现代的全自动化分析仪由于多项目同时进行测定的需要，对分光光度计作了革命性的改造，并产生了后分光技术的概念，从而使双波长分光光计光学系统的结构变得较为简单而且与单波长分光光度计有很大的区别。

所谓后分光技术是相对传统的分光光度计而言的。众所周知，光电比色法赖以建立的Lambert—Beer定律只适用于单色光，单色光纯度越高则测定结果的精密度和准确度越好，如果用混合光比色，则溶液的吸光度与液层厚度和溶液浓度间不成比例关系。因此，传统的分光光度计是以单色器（棱镜或光栅）对入射光进行分光，然后使特定波长的单色光通过待测溶液进行比色测定，而现代生化分析仪上采用所谓后分光技术的分光光度计则是直接以光源灯所发出的混合光透过待测溶液，经溶液吸收后再用全息光（Holographic 
Grating，是目前最高级的分光器件，它既可以简化光路，又可以减少杂散光，由它色散后投射到二极管矩阵上的光谱焦平面的波长精度在±2nm以内）[6]对出射光进行分光，然后将纯度很高的不同波长的单色光折射到光电二极管矩阵（Photodiode Array）上，由于位置不同，矩阵上的每一个光电二极管只能接收某个特定波长的单色光。有人据此认为这种类型的分析仪只是用某几个波长的滤光板，光不纯，波长精度差，其实这是一种误解。这种仪器在编制程序时（厂家或用户）已预先设定好某项试验选用某个波长，仪器工作时在微机的控制下只接收所选波长的光电管上产生的电信号并将其转变成相应的吸光度。

目前的大多数生化分析仪的二极管矩阵都有7到10个光电二极管，包含了从340nm～700nm范围内常用的7～10个测定波长[4,5]，有的分析仪（如美国雅培公司的EPX、SPECTRUM、CCX系列）甚至多达16个波长。

由于现代生化分析仪采用凹面全息光栅为后分光器件，从而取消了斩光器。使双波长分光光度计的结构变得相对简单，而且更为关键的是，采用这种结构的后分光技术使生化分析仪上多顶目同时测定变为现实。否则，如果仍按传统分光光度计一样以单色光进行比色测定，为适应不同顶目在短时间内用不同波长比色的需要，分光器件必须在几秒甚至更短的时间内频繁地变动反射镜的位置，这对于机械来说是难以办到的，即使制成也会易于损坏而缺乏实用价值。后分光技术的建立使上述问题迎刃而解，而且使双波长分光光度法变得更为实用。

4 、双波长法及后分光技术的现状和前景

双波长法自建立至今已有四十多年的历史，各种通用型双波长分光光度计在国外应用已相当普遍，但国产的分光光度计仍以单波长法为主。国内有人根据双波长法的基本原理，因陋就简，利用普通的单波长分光光度计（如721型）建立双波长测定法，即先用某一波长比色，记录吸光度，再用另一波长比色后记录另一吸光度，然后按双波长法进行计算，获得了较满意的结果。

近年来，应用双波长法并结合后分光技术的全自动生化分析仪已大量引进到国内，但除了厂家提供的双波长数据外，不少人在仪器上自行编制试验程序时对次波长选择的重要性往往认识不足，具有较大的随意性，由此造成试验结果误差还不知原因所在，因此有必要加强对双波长法和后分光技术的认识。但可以预见，随着国外先进仪器的引进以及国产双波长分光光度计逐步进入市场，这一新技术必将为越来越多的人所认识和接受，并在医学检验领域得到广泛的应用。

5 参考文献
（1） 王叔仁，等。双波长分光光度法.济南：山东科学技术出版，1986.
（2） 叶应妩，等主编.临床实验诊断学(上). 北京:人民卫生出版社, 1989: 137.
（3） 黄尊波,等. 双波长分光光度法在医学检验上的应用. 中华医学检验杂志,1981,4(3) :185.
（4） Service Reference Manual of 550 Express. CIBA.CORNING.
（5） Spectrophotomentric principles of measurement of the CX4.SYNCHOR 
Clinical system CX4/CX7 operating instructions. BECKMAN.
（6） [美]加里D.克理斯琴著（王令今，张振宇译）.分析化学.第3 版，北京：化学工业出版社. 1988：455～457.