PCR实验室：如何防止新冠病毒核酸检测假阳性？

来源：大医一院检验科

作者：丁大鹏

核酸检测是新型冠状病毒检测的“金标准”，实时荧光定量RT-PCR法是临床检测常用方法，随着各级实验室该方法的广泛使用，大批量样本的临床检测，假阳性也是不容忽视的问题。荧光定量PCR假阳性简单来说就是在不该出现荧光信号的样本中出现了荧光信号，导致误判断阳性结果。

出现假阳性的原因主要有以下几个方面:

一、引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的基因序列。但在临床实际中，由于基本使用的是成品试剂盒，引物设计不合适的情况一般不会出现，但个别厂家试剂仍存在非特异性扩增现象，建议在使用前进行性能评价，比对筛选。

二、靶序列或扩增产物的交叉污染，这种污染有两种原因：1.是整个基因组或大片段的交叉污染导致假阳性。2.是空气中的小片段核酸污染，虽然这些小片段比靶基因序列短，但有一定的同源性。互相拼接后与引物互补结合，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生。在规范操作的前提下，应该尽量避免第二种情况的发生。

三、标本间交叉污染：标本污染主要有收集标本的容器被污染，或标本放置时，由于密封不严溢于容器外，或容器外粘有标本而造成相互间交叉污染；标本核酸模板在提取过程中，由于吸样枪污染导致标本间污染;有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶或形成气溶胶而扩散，导致彼此间的污染。  

四、PCR试剂的污染：主要是由于在PCR试剂配制过程中，由于加样枪、容器、双蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染。

五、实验室中克隆质粒的污染：试剂盒中的阳性对照参与核酸提取过程造成交叉污染，一些试剂盒为了监控核酸提取过程的质量，要求将试剂盒中的阳性对照（含有目的基因的假病毒）与样本一起进行核酸提取，自动化的核酸提取仪由于加温、振动等过程，在操作过程中气溶胶会可能会污染提取仪。有的实验室可能会将提取的核酸样本板加膜保存，以备扩增，再次打开封膜的样本板时可能会造成交叉污染。因此，不建议对提取后的样本核酸封膜保存，最好立即检测，同时，应对每一批提取后的仪器用75%酒精擦拭。

当PCR实验结果出现假阳性的时候，我们常常会考虑是不是引物、反应液、移液器等污染模板，然后需要一一排查，费时费力。其实产生这一现象最常见的原因是核酸气溶胶。离心机离心、剧烈地摇动反应管、PCR开盖、移液器的反复吹打等会产生空气与液体表面摩擦的情况，都会产生核酸气溶胶，也就是实验室里（或移液器腔内）弥漫着含有长短不一核酸片段的小颗粒，这些小颗粒沉降到样本中导致最后扩增出了假阳性荧光曲线。

可想而知，这些核酸小颗粒还会落到实验台面、PCR仪、移液器、吸头盒等等地方，如果我们不注意，这些核酸小颗粒就会日积月累地积聚，当实验室里核酸气溶胶的浓度达到一定浓度，就会造成实验室的污染进而产生PCR实验结果的假阳性。

那么我们平常工作应在以下几方面避免核酸气溶胶污染的产生:

一、试剂要提前分装：反应液尽量分装，避免多次取用，引物与探针稀释到一定浓度后分装，保证有备份，以防一管污染之后全军覆没；

二、水需要使用无RNA酶的去离子水，可以从试剂公司购买专用水；

三、加样时动作要小心轻柔，防止将模板吸入加样器内或溅出离心管外，加样顺序是最后加模板。

四、所用离心管及加样吸头均应一次性使用。必要时，使用前反应管用紫外线照射，以破坏存在的核酸。

五、机器运行完后，取出PCR产物时不能随便丢弃，应该用塑料手套或其他打结包好后丢入垃圾桶。

在实验室日常管理方面应注意以下几方面：

一、实验室至少要分三区：试剂准备区、模板制备区、产物扩增分析区，各区配有单独移液器（有条件的每个区都应在不同的房间，这样才能最大限度的避免污染）。

二、实验室要注意风向和各区的压力差，相对压差也应从试剂准备至产物分析方向由高到低的过程;

三、定期清洁实验室，不同的区各有自己专用的抹布，台面、仪器、吸头盒、桌面、地面等接触面都需用不同浓度的含氯消毒剂擦拭清洁干净，仪器表面用75%酒精擦拭，危险区要多清洁，有条件的实验室宜采用全外排式送风。  

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