SOP文件 | 结核病细菌学检查规范

1 目的

规范标本的收集、染色剂的制备、涂片制作、染色、显微镜检查标准操作规程，确保检验结果准确可靠。

2 适用范围

各类结核菌检测的标本。

3 标本采集及处理

3.1 标本类型：痰、尿、粪、脓液、脑脊液、气管穿刺抽取的痰液等。

3.2 标本采集与处理

3.2.1 痰标本：初诊病人应送3份痰标本（夜间痰、清晨痰和即时痰）。如无夜间痰，在留清晨痰后2 ~ 3小时再留取一份痰标本；或在送痰时，留取两份即时痰。治疗中的病人按期每次送检两份痰标本（清晨痰和夜间痰）。即时痰为病人就诊时咳出的痰液，清晨痰为清晨深咳出的痰液，夜间痰为就诊前一天晚唾前咳出的痰液。痰标本应以脓样、干酪样或脓性粘液样性质的痰液为合格标本，痰量应为3 ~ 5毫升。应由检验人员或专人验收痰标本，痰液不合格者，要求重新送检。难以获得合格标本时，也应进行细菌学检查，但应注明标本性状以供分析结果时参考。

3.2.2 尿标本：收集全部晨尿，静置数小时，弃上清，取沉淀部分尿液20 ~ 30ml送检。必要时可导尿送检。

3.2.3 脑脊液：腰穿取脑脊液3 ~ 5ml，盛于无菌容器中送检。

3.2.4 穿刺液：包括胸水、腹水、心包液、关节液及鞘膜液等各种标本。胸、腹水一般取5 ~ l0ml，心包液、关节液取1 ~ 5ml，盛于无菌容器中送检。

3.2.5 脓汁标本：无菌穿刺抽取脓汁1 ~ 5ml，或以无菌纱布、棉拭擦拭脓性分泌物，放置盐水或肉汤培养基中送检。

3.2.6 气管洗涤液：在枝气管镜检查时，注入适量无菌蒸馏水，抽吸几次后，抽吸出的液体即可送检。

3.2.7 胃液：于空腹时抽取胃液或洗胃液（特别是儿童）置于无菌瓶中送检。

3.2.8 粪便标本：取粪便5 ~ 10g送检，加入灭菌蒸馏水20 ~ 40ml，用玻璃棒充分搅拌，静置30min，吸取液体部分3000rpm离心30min，取沉淀检查。

标本留取后，应即时送检。不能即时送检的标本须放4℃冰箱保存，以防标本干涸或污染。需转送外院进行结核杆菌检查的标本，应用纸张和塑料袋封装、扎牢，顺序放置于包装袋内，盒外注明勿倒置标志。同时填写外送检验单，包括病人姓名、地址、登记号（或门诊序号）、送检日期。检验单应与痰标本分别放置在不同容器中，一齐送交。

3.3 标本的验收  

检验人员收到标本后，应仔细核对标本和检验单各项内容，查看送检标本是否合格。随后按顺序编号，及时检查和登记。不能即时检查的标本须放4℃冰箱保存。

4 试剂、培养基及仪器

离心机、酒精灯、玻片、抗酸染液、显微镜、电热灼烧器、全排式生物安全柜等。

5 检验步骤

5.1 抗酸杆菌涂片检查法

取经95％乙醇擦拭脱脂过的干燥、清洁、无划痕的载玻片，于玻片背面的左端1／3处以蓝色或黑色记号笔(玻璃铅笔)编号。用折断的竹签茬端，挑取痰标本的脓样、干酪样部分约0.05 ~ 0.1ml，涂于载玻片右2／3处，均匀涂抹成2.5cm× 2.0cm大小的卵圆形痰膜，自然干燥，微火固定，抗酸染色或荧光染色后镜检。脓液标本的检查同痰涂片。胸腹水、胃液、气管洗涤液、尿液等标本，则须经3000rpm，离心30min (或8000rpm离心10min)，取沉淀涂片检查。脑脊液可放置冰箱或室温，待薄膜形成后，挑取薄膜涂片。也可将脑脊液经3000rpm，离心30min，取沉淀物涂片检查。病灶组织或干酪块等先用组织研磨器磨碎后再进行涂片检查。载玻片应一次性使用，每张玻片只 能涂一份标本。

5.2 染色方法：萋尔-尼尔逊氏(（Ziehl-Neelsen）抗酸染色法。

5.2.1 染色剂：碱性复红乙醇储存液（碱性复红8g溶于95％乙醇100ml中）l0ml加入5％石碳酸水溶液90ml混匀。

5.2.2 脱色剂：5％盐酸乙醇液（浓盐酸5ml与95％乙醇95ml混匀）。

5.2.3 复染剂：亚甲兰0.3g溶于50ml 95％乙醇中，完全溶解后加蒸馏水至100ml，混匀即为储存母液。使用时以蒸馏水10倍稀释。

5.3 染色步骤：

5.3.1 在已用火焰固定的涂片上滴加染色剂，以盖满涂片标本而不溢出载玻片为宜；在火焰上方徐徐加热至出现蒸汽（不可沸腾），染色3min；染色期间应始终保持涂片被染色液覆盖，必要时可续加染色剂及加温，但要防止干涸。待冷，水洗（流水自玻片背面轻轻冲洗掉染色液）。

5.3.2 加脱色剂，脱至无红色为止，但不可超过l0min，同上水洗。

5.3.3 加复染剂，染色30s，同上水洗，待干后镜检。

6 结果报告

用光学显微镜镜检（目镜10×，油镜100×）染色痰片。在淡蓝色背景下，抗酸杆菌呈红色，其它细菌和细胞呈蓝色。所见结果按下列标准报告：

6.1 抗酸杆菌阴性：连续观察300个不同视野，未发现抗酸杆菌。

6.2 抗酸杆菌可疑(±)：1 ~ 2条抗酸杆菌／300视野。

6.3 抗酸杆菌（1+）：3 ~ 9条抗酸杆菌／100视野。

6.4 抗酸杆菌（2+）：l ~ 9条抗酸杆菌／10视野。

6.5 抗酸杆菌（3+）：1 ~ 9条抗酸杆菌／每个视野。

6.6 抗酸杆菌（4+）：≥10条抗酸杆菌／每视野。

镜检结果应及时记录在化验报告单上。阴性结果应填记“阴性”不得以“(-)”表示。

镜检可疑结果(±)，应在报告单上注明条数。必要时重新涂片或另留标本复查。标本应在送检48小时内报告结果。

7 涂片检查的质量控制

应建立涂片检查的室内、室间质量控制制度。室内质控内容包括标本的收集、染色剂的制备、涂片制作、染色、显微镜检查、结果登记等。室内质控应每天进行，质控方式主要是自查和互查。自查是检验人员每天抽取部分涂片进行复查；互查是多名检验人员互相抽查当日10％痰片进行复验。复验结果应填写在质控记录簿上，以备检查。复验要求抗酸杆菌阳性片符合率≥98％，阴性片符合率≥96％。不允许1+以上的阳性片出现假阴性。同时，玻片必须清洁无油污，用蓝或黑色记号笔、玻璃铅笔在玻片背面编号，涂片染色后不得有肉眼可见的红色斑块（荧光染色为黄色斑块）。涂片脱落面积应在10％以下。高倍镜下每个视野的痰细胞不应少于10个。

室间质控通常是上级实验室（或专业机构）对下级实验室（或非专业机构）进行质控的方式。分现场督导和非现场督导二种方式。现场督导是检验人员赴基层实验室现场指导，抽取痰片复验。非现场督导要求基层实验室将保存近期3个月的全部痰片及实验记录送上级实验室复验。督导内容包括实验室布局、安全防护和污染物处理、涂片、染色操作、显微镜维护状况、抽取痰涂片复验、实验室日常工作记录（包括室内和室间质控）。

8 注意事项

8.1 涂厚片。

8.2 固定菌膜温度不能过高，以不烫手背为准。

8.3 加脱色剂，脱至无红色为止。

8.4 涂片和固定操作在生物安全柜中进行。

9 临床意义

结核病细菌学检查，是确定结核病诊断和化疗方案的重要依据，也是考核疗效、评价防治效果的可靠标准。结核病细菌学检查是国家结核病控制规划的重要组成部分，在结核病防治工作中中占有极其重要的地位。

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