独家专访《Cell》中国学者首次发布大规模肿瘤单细胞水平免疫图谱

关键词：肝癌  免疫T细胞   单细胞测序 新靶点

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2017年6月16日，《Cell》杂志发布重大研究成果，首次在单细胞水平上描绘了肝癌微环境中的免疫图谱，通过对超过5000个T细胞的单细胞测序数据及分析，发现可能的肝癌靶点基因，基因慧对此次课题的通讯作者张泽民教授进行了独家采访并深度报道如下。文献链接见文末。

注：本文经过论文作者审核。转载请注明来自基因慧。欢迎投稿、合作（[e-mail]）。

图1：  肿瘤免疫细胞单细胞测序技术路线。图片来自《Cell》

1. 北大、世纪坛医院、Amgen合作

• 技术研发和转发跟进

• 学校、医院和药厂协同

跨机构、跨国合作，包括：

• 北大学生命科学学院BIOPIC中心、北京未来基因诊断高精尖创新中心、北大-清华生命科学联合中心张泽民研究组

• 首都医科大学附属北京世纪坛医院暨北京大学第九临床医学院肝胆胰外科彭吉润研究组

• 美国AMGEN公司的欧阳文君研究组

作为共同通讯作者在《Cell》杂志发表了题为“Landscape of infiltrating T cells in liver cancer revealed by single-cell sequencing” 的研究论文，首次在单细胞水平上描绘了肝癌微环境中的免疫图谱。

北京大学生命科学学院BIOPIC中心博士后郑春红，博士研究生张园园、郭心怡，前沿交叉研究院博士研究生郑良涛，北京大学医学部博士研究生郭化虎和美国AMGEN公司博士后Jae-Kwang Yoo为该论文的并列第一作者。

2. 探索肝癌新靶点和生物标记物

• 肝癌组织内富含大量肿瘤浸润淋巴细胞

• 肝癌免疫治疗鲜有报道

• 单细胞测序解决异质性问题

中国肝癌发病率居世界之首，且术后存活率较低，之前的研究表明肝癌组织内富含大量肿瘤浸润淋巴细胞。

癌症免疫疗法是近年新兴的极具潜力的治疗方法，尤其是免疫检查点抑制剂疗法，如CTLA-4抗体Ipilimumab及PD-1抗体pembrolizumab目前都取得良好的疗效。但是相比于免疫疗法在黑色素瘤及肺癌等肿瘤上的成果，目前成功的针对肝癌的免疫治疗方法却鲜有报道。

单细胞肿瘤组学研究为什么受到重视？虽然免疫治疗可以达到显著的临床效果，但是在不同病人或者不同癌种之间的效果却很不均一。DNA变异的数目、肿瘤浸润淋巴细胞的水平以及药物靶点的表达等因素都会影响到各类肿瘤免疫治疗的效果。由于参与肿瘤发生发展的免疫细胞类型多样且异质性很强，只有开展单细胞水平的研究才能真正获得系统详尽的肿瘤免疫图谱，从而助力于肿瘤免疫疗法的发展及有效的靶点和生物标志物的发现。

肿瘤靶点和生物有效标志物是新药研究重难点之一。通过深刻了解肝癌的肿瘤免疫微环境来探索新的肿瘤免疫疗法及寻找新靶点和有效的生物标志物，对于肝癌的诊断和治疗具有重大意义。

3. 探索技术路线

• 单细胞测序：超过5000个T细胞的数据

• 转录组及TCR序列分析

基因慧：这项研究中，据称通过血液和细胞都进行了单细胞测序和常规DNA/RNA测序，最后得到转录表达谱和TCR序列图谱，您能简要谈谈技术路线吗，其中有哪些突破和创新呢？

张泽民教授：近年来，近年来，单细胞转录组测序技术已经快速发展，并被广泛用于癌症研究。之前《科学》杂志报道了采用单细胞测序技术对黑色素瘤中的浸润T细胞的特质研究工作，但对T细胞的分型相对简单，样本采集部位单一且数量较小。本课题组通过对外周血、癌旁和肿瘤三个部位的T细胞进行采集分析，能够发现肿瘤特异的T细胞亚群以及表达谱、TCR谱特征，对研究肿瘤免疫机制具有指导性的意义，大规模的样本量和深度测序能使我们获得更多的结果和更深层次的发现。此外，不同于之前仅关注于基因表达分析的单细胞研究，本研究使用国际领先的生物信息学方法对单细胞转录组数据进行分析，同时得到了单个T细胞的基因表达图谱并组装出其所对应的TCR序列，从而不但可以分析单个T细胞的免疫状态还能追踪不同T细胞的来源及家谱，立足于T细胞的独特特征从多角度对T细胞的功能和免疫学特征进行分析研究，进而揭示肿瘤中T细胞的特有状态并研究了肿瘤中T细胞的状态转换过程。

4. 研究成果

• 亚群特异基因表达

• CD8 T细胞的功能紊乱及抑制性T细胞特异表达基因

• 描绘了初始T细胞向耗竭状态的发展轨迹

• 在耗竭性CD8 T细胞亚群中发现了一类FOXP3+抑制性T细胞的存在

基因慧：张教授，这次在《Cell》上发表的科研成果，据说是国际上首次大规模针对肿瘤相关T细胞的单细胞组学研究，您能通俗地向基因慧读者谈谈这项研究成果吗?

张泽民教授：我们的这项研究成果主要是在单细胞水平对肝癌肿瘤微环境中T淋巴细胞的转录组及T细胞受体(TCR)序列进行综合分析，基于生物信息学分析，通过对T细胞进行亚群分类、发展轨迹分析及比较不同亚群中T细胞克隆的分布，来探索不同亚群之间的关系并鉴定每个亚群特异的基因表达，从而揭示肿瘤中的T细胞在功能、分布和发展状态等方面的独特性质。肿瘤在免疫系统中出现逃逸的主要原因包括杀伤性CD8 T细胞的功能紊乱及抑制性T细胞的大量存在，针对这两类细胞寻找靶点是免疫疗法的主要方向。我们的研究着重探索了肿瘤中这两类细胞的特异表达基因，发现基因Layilin在这两群细胞中均特异性表达，并通过体外实验证明该基因对于CD8 T细胞的杀伤功能有抑制调节作用，可能作为一个免疫疗法的新靶点。同时，基于TCR数据分析，我们的研究发现肝癌内存在大量肿瘤组织特异的克隆增生的T细胞，但是这些细胞大多处于耗竭状态，从而揭示了肿瘤细胞逃逸免疫监视的原因。此外，我们的研究还描绘了初始T细胞向耗竭状态的发展轨迹，并在耗竭性CD8 T细胞亚群中发现了一类FOXP3+抑制性T细胞的存在，提出了耗竭T细胞会进一步发展成抑制性T细胞的潜在发展方向。

5.  展望落地临床

• 为后续了免疫疗法提供了新的潜在靶点

• 验证了个别基因的功能，动物模型和临床试验还待进行

基因慧：课题组发现杀伤性CD8 T细胞和抑制性T细胞的特异表达基因，这对于临床有什么指导意义呢？未来如果落地临床，还有哪些工作要做呢？

张泽民教授：基于T细胞的治疗方法是目前最为成功的癌症免疫疗法，因此研究癌症中T细胞与肿瘤微环境的相互作用机制成为打开新免疫疗法宝箱的钥匙，尤其是免疫检查点抑制剂疗法，如CTLA-4抗体Ipilimumab及PD-1抗体pembrolizumab目前都取得良好的疗效，而这种免疫检查点抑制剂疗法正是基于“唤醒”杀伤性CD8 T细胞的功能或者抑制抑制性T细胞的功能来实施治疗的，因而分别针对“功能紊乱”的杀伤性CD8 T细胞和抑制性T细胞来寻找他们的特有基因将有助于寻找新的治疗靶点。最终，我们找到了多个特异性的靶点并初步验证了个别基因的功能，为后续了免疫疗法提供了新的潜在靶点，当然大量的后期验证工作，例如小鼠等哺乳动物模型的验证，以及大量的临床试验等还有待进行。

图2：  肝癌单细胞测序。图片来自《Cell》

6. 肝癌免疫图谱和新药研发

• 单细胞水平的研究来获得系统详尽的肿瘤免疫图谱

• 助力于有效的靶点和生物标志物的发现

• 初步验单细胞转录组数据分析得到一个靶点抑制CD8 T细胞的杀伤性功能

基因慧：这次合作Amgen参与其中，您对于肝癌免疫图谱和新药研发的意义有多大，中间的距离有多远？

张泽民教授：中国的肝癌发病率居世界之首，目前主要的治疗方法还是以手术及放疗/化疗等传统方法为主，而新兴的极具潜力的相关癌症免疫疗法却鲜有报道，这就需要我们深刻了解肝癌的肿瘤免疫微环境来探索相应的肿瘤免疫治疗方法。通过开展单细胞水平的研究来获得系统详尽的肿瘤免疫图谱，会极大地助力于肿瘤免疫疗法的发展及有效的靶点和生物标志物的发现。本课题的合作方Amgen公司是一家有丰富新药开发经验的知名企业，项目合作方的主要负责人欧阳文君博士及其所领导的团队拥有丰富的免疫学知识及新药研发能力。截至目前为止，Amgen研究团队已经初步验证了单细胞转录组数据分析所得到的其中一个靶点的功能，结果表明这个基因确实对CD8 T细胞的杀伤性功能有抑制作用，后续更多的功能验证及其他潜在靶点的研究正在进行中。

7. 学校、医院、药厂协同合作

• 大胆尝试最新的生物信息学分析方法，如细胞聚类及TCR序列组装等

• 免疫领域及应用转化，拓展研究意义

基因慧：这次课题在北大-清华，北京世纪坛医院，Amgen公司这样科研、临床和产业的三方合作下，由您领导的研究组和彭吉润研究组及欧阳文君研究组共同完成，您能谈谈这样跨组织合作中的关键点是什么呢？其中有哪些可以分享的故事呢？

张泽民教授：首先，我很感谢课题的合作方北京世纪坛医院的彭吉润研究组和Amgen公司的欧阳文君研究组。对于这种多方合作、多角度研究的大项目，不同课题组之间的高效协同作业，最大限度地发挥每个团队的力量是整个项目顺利开展的关键因素。在项目初始阶段，我们和彭吉润研究组的同学通力合作，探索了整个项目的具体实施细节，包括病人入组条件、取样要求、单细胞转录组扩增方法等，同时还发挥了本研究组生物信息学分析的优势，大胆尝试最新的生物信息学分析方法，如细胞聚类及TCR序列组装等，从而保证项目的高效推进和运行。到项目后期，Amgen公司欧阳文君研究组的加入进一步加强了本课题在免疫领域及应用转化方面的研究，从而进一步升华了整个课题的意义，这些对于整个课题的最终完成都有重要意义。

8. 科技部“精准医学”专项资助

• 把基础研究和转化研究紧密融合

• 学校、医院和制药企业的协同攻关

基因慧：在科技部2016年启动的“精准医学专项”中，您的课题组承担了项目，这次研究是否属于这个专项呢？我们陆续启动大规模的组学技术研发项目，您参与其中，对于产学研的合作有什么体会和对未来的期待呢？

张泽民教授：这项工作确实由“精准医学专项”中的“临床用单细胞组学技术研发”项目资助，同时本项工作也得到了国家自然基金、北大-清华生命科学联合中心和北京未来基因诊断高精尖创新中心的资助。我们感谢各项基金对我们工作的支持。相比于十年前，现在从基础研究到药物研发之间的转化时间越来越短，甚至可以说是齐头并进，把科研武断地分割成基础研究和转化硏究已经是一个过时的概念。我曾经在基因泰克工作多年，有丰富的工业界做科研的经历，把基础研究和转化研究紧密融合一直是我追求的科研模式。这个项目中学校、医院和制药企业的协同攻关恰恰体现了产学研结合的趋势，我们会继续这样的模式，把我们的技术和经验推广到更多的癌症类型上去。

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