凌恩客户文献|山羊转录组分析揭示免疫相关基因的差异表达

凌恩生物团队助力客户完成感染BVDV后山羊外周血单个核细胞（PBMCs）中免疫相关基因表达差异的转录组分析，研究成果成功发表在BMC Genomics杂志（IF=3.501）。

文章设计简洁明了，分析思路清晰，在转录组分析中值得借鉴。

研究背景

牛病毒性腹泻病毒（BVDV）是家庭和野生反刍动物重要的病毒病原体。小型反刍动物（山羊和绵羊）也是BVDV的易感宿主。BVDV感染可以干扰宿主的先天免疫和适应性免疫。为了进一步了解引起这些免疫的功能基因和作用机制，研究人员通过RNA-Seq技术研究了用BVDV-2感染的山羊外周血单核细胞（PBMC）的转录组分析。

研究设计

首先购买山羊，研究中所用的山羊接种了山羊痘病毒，口蹄疫病毒，小反刍兽疫病毒和Mycoplasma mycoides subsp.capri疫苗。分别使用RT-PCR、病毒中和试验进一步筛选动物的BVDV以及病毒特异性中和抗体。分别在感染BVDV病毒6、12和24小时收集山羊（n = 3）全血，提取总RNA进行转录组分析。

研究结果

1、通过RT-PCR和qRT-PCR测定，山羊PBMC被BVDV-2成功感染。感染后12 h的RNA-Seq分析结果显示感染和模拟感染的PBMC之间有499个差异表达的基因。在这些基因中，97个被上调，其余352个基因被下调。

鉴定山羊PBMC中的病毒感染。A.在BVDV-2感染后6、12和24小时通过RT-PCR扩增5'UTR。泳道1：12hpi的模拟感染PBMC；泳道：6hpi感染的PBMC；泳道3：12hpi感染的PBMC；泳道4：24hpi感染的PBMC；泳道5：DNA Marker DL-2000 plus。B. 在不同时间点通过qRT-PCR检测山羊PBMC中的病毒基因组拷贝数。

12hpi模拟和BVDV-2感染样品之间差异表达基因的总结

2、GO富集分析发现鉴定的DEG在运动/定位、免疫应答、炎症反应、防御反应、细胞因子产生的调节等方面显著富集。

3、为了进一步定义DEGs功能，进行了KEGG通路/富集分析。发现差异基因在15种通路中显著富集的：细胞因子-细胞因子受体相互作用，TNF信号通路，趋化因子信号通路，补体和凝血级联和NOD样受体信号通路等。

4、蛋白与蛋白相互作用（PPI）网络分析表明大多数DEG与先天或适应性免疫应答，炎症反应和细胞因子/趋化因子介导的信号传导途径有关。在上调的基因中，TNF, IL-6, IL-10, IL-12B, GM -CSF, ICAM1, EDN1, CCL20,CXCL10和CCL5位于网络的核心，并与许多其他DGE相连；对于下调基因，关键点包括CCL2, MAPK11, MAPK13, CSF1R和LRRK1等，它们与更多基因相关。

差异基因PPI网络基于STING分析结果和折叠变化信息。上调的基因以红色显示，下调的基因以蓝色显示，梯度显示表达程度。

5、为了进一步验证RNA-Seq数据，选择了18个与免疫应答相关的DEG用于qRT-PCR分析。RNA-Seq和qRT-PCR结果之间的相关系数很高（R² = 0.91）。通过Western印迹或ELISA进一步测定一些DEG，膜联蛋白A2的表达明显下降（下图a），TNF-α，GM-CSF和IL-6的表达显着增加（下图b）。此外，Viperin（用作对照）表达显示感染组和模拟感染组之间没有变化，这与RNA-Seq结果一致。这些结果证实RNA-Seq鉴定的差异表达基因是可靠的。

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总之，山羊PBMCs的BVDV-2感染引起一系列与宿主免疫反应相关的DEG的转录变化，包括炎症、防御反应、细胞运动、细胞因子/趋化因子介导的信号传导等。研究通过RNA-Seq分析观察了BVDV-2感染的山羊PBMC中一系列免疫相关基因的变化。该结果将有助于探索和进一步了解宿主对山羊BVDV-2感染的反应。

参考文献

Transcriptome analysis reveals differential immune related genes expression in bovine viral diarrhea virus-2 infected goat peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). BMC Genomics, 2019.

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